[發明專利]一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法和系統

有效

• 申請號: 201910454917.1
• 申請日: 2019-05-29
• 公開（公告）號: CN110066852B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 王永明;胡子英;王大奇
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 王潔平

本發明屬于基因編輯技術領域，具體為一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法和系統。本發明方法的具體步驟如下：(1)構建包含PAM序列的質粒文庫；(2)構建包含PAM序列的慢病毒文庫；(3)構建包含PAM序列文庫的細胞系；(4)流式分選去除熒光報告基因假陽性背景；(5)轉染CRISPR/Cas至包含PAM序列文庫的細胞系進行編輯；(6)流式分選出熒光報告基因陽性細胞，通過PCR構建二代測序文庫；(7)生物信息學分析二代測序結果，找出能夠產生基因編輯的PAM序列。本發明將快速篩選出在哺乳動物細胞中能產生基因編輯的CRISPR/Cas系統，并通過測序找出其需要的PAM序列。

技術領域

本發明屬于基因編輯技術領域，具體涉及一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas基因編輯系統PAM序列的方法和系統。

背景技術

CRISPR/Cas系統是原核生物在長期進化中形成的一種獲得性免疫，用于抵抗外源質粒和噬菌體的入侵。研究表明，靶向序列附近必須有PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列時，CRISPR/Cas系統才能實現對靶位點的識別和切割。因此準確地鑒定出CRISPR/Cas系統識別的PAM序列是利用其進行基因編輯的必要條件。

目前用于鑒定CRISPR/Cas系統所識別PAM序列的方法主要有兩種，一種是用Cas蛋白和gRNA體外切割含有多種PAM的靶向DNA序列，然后將酶切產物進行二代測序分析識別的PAM序列；另一種是在細菌中將PAM序列和抗性基因結合，通過負向篩選以及二代測序分析識別PAM序列。但是研究表明利用這兩種方法鑒定出來的CRISPR/Cas系統在哺乳動物細胞中不一定能有活性。利用體外切割實驗鑒定PAM序列時，鑒定的結果受反應條件的影響。

鑒于以上問題，特提出本發明。

發明內容

本發明提供一種基于報告基因的檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法和系統，本發明能快速篩選出在哺乳動物細胞中能產生基因編輯的CRISPR/Cas系統，并通過測序找出其需要的PAM序列。本發明的技術方案具體介紹如下。

一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法，具體步驟如下：

(1)構建包含PAM序列的質粒文庫

1)設計并合成包含gRNA靶位點和若干個兼并堿基的寡核苷酸單鏈PAM序列文庫；gRNA靶位點由gRNA結合序列與PAM序列組成，PAM序列由2個以上堿基N串聯組成，所述堿基N為堿基A、T、C或G；

2)通過PCR將寡核苷酸單鏈PAM序列文庫變為雙鏈DNA；

3)將雙鏈DNA插入至啟動子與熒光報告基因之間，啟動子用于下游熒光報告基因的轉錄；

4)提取質粒，即完成包含PAM序列的質粒文庫的構建；

(2)構建包含PAM序列的慢病毒文庫

1)將哺乳動物細胞鋪板至培養皿中；

2)將包含PAM序列的質粒文庫與慢病毒輔助質粒共轉染哺乳動物細胞；

3)收集慢病毒上清，并進行濃縮；

4)測定慢病毒滴度，即完成包含PAM序列的慢病毒文庫的構建；

(3)構建包含PAM序列文庫的細胞系；

(4)流式分選去除熒光報告基因假陽性背景；

(5)轉染Cas9蛋白和gRNA或表達Cas9蛋白和gRNA的載體至包含PAM序列文庫的細胞系進行編輯；

(6)流式分選出熒光報告基因陽性細胞，提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過PCR構建二代測序文庫；