[發明專利]一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法和系統

有效

• 申請號: 201910454917.1
• 申請日: 2019-05-29
• 公開（公告）號: CN110066852B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 王永明;胡子英;王大奇
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 王潔平

1.一種在哺乳動物細胞中檢測CRISPR/Cas PAM序列的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)構建包含PAM序列的質粒文庫

1)設計并合成包含gRNA靶位點和若干個兼并堿基的寡核苷酸單鏈PAM序列文庫；gRNA靶位點由gRNA結合序列與PAM序列組成，PAM序列由2個以上堿基N串聯組成，所述堿基N為堿基A、T、C或G；

2)通過PCR將寡核苷酸單鏈PAM序列文庫變為雙鏈DNA；

3)將雙鏈DNA插入至啟動子與熒光報告基因之間，啟動子用于下游熒光報告基因的轉錄；

4)提取質粒，即完成包含PAM序列的質粒文庫的構建；

(2)構建包含PAM序列的慢病毒文庫

1)將哺乳動物細胞鋪板至培養皿中；

2)將包含PAM序列的質粒文庫與慢病毒輔助質粒共轉染哺乳動物細胞；

3)收集慢病毒上清，并進行濃縮；

4)測定慢病毒滴度，即完成包含PAM序列的慢病毒文庫的構建；

(3)構建包含PAM序列文庫的細胞系；

(4)流式分選去除熒光報告基因假陽性背景；

(5)轉染Cas9蛋白和gRNA或表達Cas9蛋白和gRNA的載體至包含PAM序列文庫的細胞系進行編輯；

(6)流式分選出熒光報告基因陽性細胞，提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過PCR構建二代測序文庫；

(7)生物信息學分析二代測序結果，找出能夠產生基因編輯的PAM序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，gRNA靶位點及兼并堿基位于起始密碼子ATG和熒光報告基因之間。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，啟動子選自CMV、EF1α、SV40、PGK1、Ubc、CAG、TRE或human beta actin中的任一種。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，熒光報告基因選自GFP、RFP、BFP、EGFP、mCherry、mStrawberry、mApple、mRuby或EosFP中任一種。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，哺乳動物細胞包括但不限定于HEK293T細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、HIH3T3細胞、U2-OS骨肉瘤細胞、A549細胞、K562細胞。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，構建包含PAM序列文庫的細胞系的方法如下：

1)將哺乳動物細胞鋪板至培養皿中；

2)將包含PAM序列的慢病毒文庫感染哺乳動物細胞；

3)用抗生素進行篩選后，即得到包含PAM序列文庫的細胞系。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，編輯2天～7天。

8.一種基于權利要求1所述的方法的系統，其特征在于，其包括啟動子、gRNA靶位點、兼并堿基和熒光報告基因；啟動子用于下游熒光報告基因的轉錄，gRNA靶位點由gRNA結合序列與PAM序列組成，PAM序列由2個以上堿基N串聯組成，所述堿基N為堿基A、T、C或G；gRNA靶位點及兼并堿基位于ATG起始密碼子和熒光報告基因之間。