[發(fā)明專利]一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法及其應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910453104.0 | 申請日： | 2019-05-28 |
| 公開（公告）號： | CN110106196A | 公開（公告）日： | 2019-08-09 |
| 發(fā)明（設計）人： | 姚凱;覃歡;張士堯;馮源;張文良;姚浩哲;肖鸚;王佳汝;吳嘉軒 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢科技大學 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63 |
| 代理公司： | 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247 | 代理人： | 陳凱 |
| 地址： | 430000 *** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 目的基因 多聚核苷酸 目標產(chǎn)物 長片段 酶切位點序列 激酶構(gòu)建 目的片段 載體片段 磷酸化 構(gòu)建 分子生物學技術 退火 寡核苷酸 技術要點 堿基突變 經(jīng)濟成本 連接產(chǎn)物 酶切產(chǎn)物 序列片段 載體質(zhì)粒 粘性末端 激酶 酶切 分段 應用 合成 回收 概率 | ||
1.一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1：將目的基因序列根據(jù)實際需要分段，并分別在每段的兩端加入酶切位點序列，然后合成相應目標產(chǎn)物序列片段；
S2：利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端將目標產(chǎn)物磷酸化；
S3：將磷酸化的目標產(chǎn)物退火，得到目的片段；
S4：將載體質(zhì)粒酶切，所形成的粘性末端與步驟S1中所加入的酶切位點序列對應，并回收酶切產(chǎn)物，得到載體片段；
S5：將目的片段與載體片段連接，得到連接產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法，其特征在于：在步驟S5后面依次增加S6、S7，其中，
S6：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中，并進行抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)；
S7：對S6中抗性培養(yǎng)陽性的菌株提取質(zhì)粒并測序，通過序列比對判斷是否成功構(gòu)建質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法，其特征在于：步驟S1中，目標產(chǎn)物合成后，用pH為8.5，濃度為10mmol/L的Tris-HCl配制濃度為0.25nmol/L的目標產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法在構(gòu)建長片段目的基因中的應用。
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的一種通過多聚核苷酸激酶構(gòu)建長片段目的基因的方法在構(gòu)建長片段目的基因的試劑盒中的應用。
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