[發明專利]一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法及其應用

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• 申請號: 201910453104.0
• 申請日: 2019-05-28
• 公開（公告）號: CN110106196A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 姚凱;覃歡;張士堯;馮源;張文良;姚浩哲;肖鸚;王佳汝;吳嘉軒
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法及其應用。本發明提供的構建長片段目的基因的方法能夠有效降低目的基因構建時的經濟成本，同時，降低堿基突變的概率。其技術要點包括：將目的基因序列根據實際需要分段，并分別在每段的兩端加入酶切位點序列，然后合成相應目標產物序列片段；利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端將目標產物磷酸化；將磷酸化的目標產物退火，得到目的片段；將載體質粒酶切，所形成的粘性末端與第一步中所加入的酶切位點序列對應，并回收酶切產物，得到載體片段；將目的片段與載體片段連接，得到連接產物。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法及其應用。

背景技術

DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實現的。DNA連接酶催化具有平末端或互補粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3’羥基末端，5’磷酸末端形成磷酸二酯鍵連接起來，該反應為需能反應，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對粘性末端的連接效率要遠高于對平末端的連接效率。在基因工程實驗中，最常用連接酶是的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。其對于平末端或互補的粘性末端可直接進行連接反應。一個片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個片段都是粘性末端但不配對，則需要通過各種方式使其可匹配或通過平末端進行連接。通常采用末端補平、加同聚物尾、加接頭等方式使目的片段之間能夠匹配。

很多公司在合成引物時，若客戶無特殊要求，引物的5’端都是去磷酸化的，一般只有客戶要求的時候，才會給合成磷酸化的5’末端，并且需要另外收取較高的費用，這給本就價格不菲的序列合成工作又增加了一些經濟負擔。

發明內容

基于現有技術的缺陷，本發明提供了一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法及其應用，使用本方法構建長片段目的基因所需的成本較低，具有更好的經濟效益。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法，包括以下步驟：

S1：將目的基因序列根據實際需要分段，并分別在每段的兩端加入酶切位點序列，然后合成相應目標產物序列片段；

S2：利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端將目標產物磷酸化；

S3：將磷酸化的目標產物退火，得到目的片段；

S4：將載體質粒酶切，所形成的粘性末端與步驟S1中所加入的酶切位點序列對應，并回收酶切產物，得到載體片段；

S5：將目的片段與載體片段連接，得到連接產物。

進一步地，在步驟S5后面依次增加S6、S7，其中，

S6：將連接產物轉化至宿主菌中，并進行抗性培養基培養；

S7：對S6中抗性培養陽性的菌株提取質粒并測序，通過序列比對判斷是否成功構建質粒。

進一步地，步驟S1中，目標產物合成后，用pH為8.5，濃度為10mmol/L的Tris-HCl配制濃度為0.25nmol/L的目標產物。

一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法在構建長片段目的基因中的應用。

一種通過多聚核苷酸激酶構建長片段目的基因的方法在構建長片段目的基因的試劑盒中的應用。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：