[發(fā)明專利]皂苷元內(nèi)酯的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910451715.1
• 申請日: 2019-05-28
• 公開（公告）號: CN110157763B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設計）人: 車彥云;張雅瓊;饒高雄;趙毅;白春艷;吳三同
• 申請（專利權）人: 云南中醫(yī)藥大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C07J71/00
• 代理公司: 北京悅成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 高艷麗

1.一種皂苷元內(nèi)酯的制備方法，所述的皂苷元內(nèi)酯為皂苷元α-苦丁內(nèi)酯，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將苦丁茶冬青皂苷D溶于有機溶劑中形成樣品溶液；

(2)制備腸道菌孵育液；制備腸道菌孵育液包括以下步驟：

(a)制備滅菌厭氧培養(yǎng)基；

(b)取糞便與生理鹽水混合均勻制成混懸液，所述混懸液中糞便與生理鹽水的配比為1mg:2～6mL；

(c)取混懸液沉淀后的上清液，加入滅菌厭氧培養(yǎng)基混勻，然后將混合液恒溫振蕩厭氧培養(yǎng)15～35h，得到腸道菌孵育液；其中，上清液與滅菌厭氧培養(yǎng)基的體積比為1:6～12；

(d)將步驟(c)制備的腸道菌孵育液經(jīng)過分離和鑒定，分離出腸球菌孵育液或擬桿菌孵育液作為步驟(2)中的腸道菌孵育液；

(3)將樣品溶液與腸道菌孵育液混合均勻后得混合液，將混合液置于厭氧環(huán)境中恒溫振蕩培育20～150h，培育后的混合液加入萃取溶劑進行萃取，萃取后取上清液，然后除去萃取溶劑得到殘渣，將殘渣溶于甲醇中，得到醇溶液；

(4)將醇溶液通過反相液相色譜柱分離，收集皂苷元α-苦丁內(nèi)酯流出時間段內(nèi)的流出液，將收集的流出液濃縮得皂苷元α-苦丁內(nèi)酯。

2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，將苦丁茶冬青皂苷D溶于二甲基亞砜中，再加入無菌水得到樣品溶液；其中，樣品溶液中的苦丁茶冬青皂苷D的濃度為1～6mg/mL。

3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(c)中，所述混懸液經(jīng)離心沉淀處理，處理時間為5～15min，離心頻率為2000～6000rpm；所述混合液在36～38℃下恒溫振蕩，振蕩頻率為100～200rpm。

4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，樣品溶液與腸道菌孵育液的體積比為1:1～20；萃取溶劑為乙酸乙酯-水飽和正丁醇的混合溶劑，混合液與乙酸乙酯-水飽和正丁醇的混合溶劑的體積比為1:0.2～10；乙酸乙酯-水飽和正丁醇的混合溶劑中，乙酸乙酯與水飽和正丁醇的體積比為1:0.5～2。

5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述混合液于36～38℃下恒溫振蕩培育，振蕩頻率為100～300rpm；萃取時進行蝸旋和離心處理，蝸旋1～10min，離心處理為1～20min，離心頻率為2000～20000rpm。

6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟：將步驟(3)獲得的醇溶液進行離心處理，處理時間為1～20min，處理頻率為2000～20000rpm，再通過0.2～0.5μm的濾膜過濾，然后通過反相液相色譜柱分離。

7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，反相液相色譜柱為C18色譜柱，沖洗液為濃度70～85vol％的甲醇水溶液。

8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，皂苷元α-苦丁內(nèi)酯流出時間段為15～18min。