[發(fā)明專利]一種檢測(cè)試劑板及檢測(cè)MMP-3含量的試劑盒及其檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910447625.5
• 申請(qǐng)日: 2019-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110068680A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳功祥;伍傳麗;徐首丁;胡小芳;王名利;畢瑞春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;G01N33/533
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

1.一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，包括：固定板，固定在固定板上并滴加樣品的樣品墊，固定在固定板上并接收樣品的層析膜，設(shè)置于所述層析膜上并固定有抗體1的檢測(cè)線T，設(shè)置于所述層析膜上并固定有多克隆抗體的質(zhì)控線C，設(shè)置于所述樣品墊和層析膜之間并固定有熒光標(biāo)記的抗體2的結(jié)合墊，連接于所述層析膜并固定在固定板上的吸水層。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，所述層析膜為硝酸纖維素膜。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，所述抗體1為第二種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體，所述抗體2為結(jié)合有納米熒光微球的第一種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，所述第二種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體的細(xì)胞株克隆號(hào)為：Clone#10D6；所述第一種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體的細(xì)胞株克隆號(hào)為：Clone#50647。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，所述納米熒光微球?yàn)轸然{米熒光微球，微球直徑100-400nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)試劑板，其特征在于，所述結(jié)合墊為玻璃纖維膜。

7.一種檢測(cè)MMP-3含量的試劑盒，其特征在于，包括：檢測(cè)試劑板，質(zhì)控品，校準(zhǔn)卡；所述檢測(cè)試劑板包括：固定板，固定在固定板上并滴加樣品的樣品墊，固定在固定板上并接收樣品的層析膜，設(shè)置于所述樣品墊和層析膜之間并固定有熒光標(biāo)記的第一抗體的結(jié)合墊，連接于所述層析膜并固定在固定板上的吸水層，設(shè)置于所述層析膜上并固定有第二抗體的檢測(cè)線T，設(shè)置于所述層析膜上并固定有多克隆抗體的質(zhì)控線C；

所述第一抗體為結(jié)合有納米熒光微球的第一種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體，所述第二抗體為第二種鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體；

質(zhì)控品為：含有50ng/ml的基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗原的Tris-HCl緩沖液；

校準(zhǔn)卡的定標(biāo)點(diǎn)包括：0ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml和2000ng/ml。

8.一種檢測(cè)MMP-3含量的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下內(nèi)容：

將鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3單克隆抗體1固定于層析膜的檢測(cè)線T處，將鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3單克隆抗體2標(biāo)記納米熒光微球后固定在結(jié)合墊上；

將兔抗人多克隆抗體固定在層析膜的質(zhì)控線C上，用于做對(duì)照線；

C和T處的復(fù)合物中的納米熒光微球在激發(fā)光360-400nm波長(zhǎng)的作用下，產(chǎn)生波長(zhǎng)為610nm-650nm的發(fā)射光，在層析膜的檢測(cè)線C和T處形成紅色的熒光條帶；

檢測(cè)線T熒光條帶信號(hào)的強(qiáng)弱與待測(cè)物質(zhì)的濃度呈正相關(guān)線性關(guān)系，隨著待測(cè)樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶-3濃度增加，檢測(cè)線T處的熒光信號(hào)增強(qiáng)；

通過(guò)熒光信號(hào)的值計(jì)算待測(cè)樣本中的基質(zhì)金屬蛋白酶-3的含量；具體計(jì)算方法：將校準(zhǔn)卡定標(biāo)點(diǎn)信息輸入到熒光檢測(cè)儀器上，得到每批產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；該標(biāo)準(zhǔn)曲線采用分段線性進(jìn)行擬合，每段線性擬合公式為y＝kx+b，x為基質(zhì)金屬蛋白酶-3含量；y為熒光信號(hào)值。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測(cè)MMP-3含量的檢測(cè)方法，其特征在于，標(biāo)記納米熒光微球的具體方法包括如下步驟：

步驟一，活化；使用Tris-HCl緩沖液稀釋納米熒光微球，然后加入EDC和NHS，室溫反應(yīng)，離心去上清；

步驟二，反應(yīng)；將活化完成的納米熒光微球用Tris-HCl緩沖液稀釋混勻，加入過(guò)量的鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體2，室溫反應(yīng)；

步驟三，封閉；在得到的反應(yīng)體系中加入BSA進(jìn)行封閉反應(yīng)；離心棄上清；

步驟四，保存；離心物加入Tris-HCl緩沖液，在溫度為4度的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種檢測(cè)MMP-3含量的檢測(cè)方法，其特征在于，標(biāo)記納米熒光微球的具體方法包括如下步驟：

步驟一，活化；使用Tris-HCl緩沖液稀釋納米熒光微球，然后加入EDC和NHS，室溫反應(yīng)15min，離心去上清；所述Tris-HCl緩沖液的pH值為6.0，所述EDC的終濃度為2mM，NHS的終濃度為5mM；

步驟二，反應(yīng)；將活化完成的納米熒光微球用Tris-HCl緩沖液稀釋混勻，加入過(guò)量的鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-3抗體2，室溫反應(yīng)2h；所述Tris-HCl緩沖液的pH值為6.0；

步驟三，封閉；在得到的反應(yīng)體系中加入BSA進(jìn)行封閉反應(yīng)2h；離心棄上清；所述BSA的終濃度為1％；

步驟四，保存；離心物加入Tris-HCl緩沖液，在4℃下保存?zhèn)溆茫凰鯰ris-HCl緩沖液的pH值為6.0，終濃度為50mM。