[發(fā)明專利]條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠的培育方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910444912.0
• 申請日: 2019-05-27
• 公開（公告）號: CN110117616A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 郭佳;劉章鎖;余樸;龔如軍;劉東偉;喬潁進;潘少康;周思捷;周夢文;雷敏;劉勇;鄭文;楊圓圓
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

本發(fā)明涉及條件性敲除lncRNA DLX6?os1轉(zhuǎn)基因小鼠的培育方法，有效解決作為動物模型，適用于不同組織器官中研究該lncRNA的作用問題，構建Dlx6?os1條件敲除載體，Dlx6?os1基因，轉(zhuǎn)錄物：Dlx6?os1?201 ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6號染色體上的三個外顯子，以三個外顯子作為條件敲除區(qū)域；將C57BL/6小鼠基因文庫中RP24?276P7 and RP24?260F14的BAC克隆作為模板，進行PCR；在目的載體中，Neo位點旁插入自刪除錨定位點，基因敲除區(qū)域旁插入loxP位點，DTA陰性選擇；與Cre酶介導的基因重組，得基因敲除質(zhì)粒載體；將基因敲除質(zhì)粒載體導入ES細胞中，與多種不同器官帶有Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到在不同器官中降低DLX6?os1表達水平的陽性小鼠。本發(fā)明適用于在不同組織器官中研究該lncRNA的作用，開拓了對糖尿病診斷治療的新途徑。

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)學生物，特別是一種條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠的培育方法。

背景技術

近年來研究表明，長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）與糖尿病腎病具有密切的關系，但相關研究報道很少，也沒有關于糖尿病腎病患者LncRNA表達譜的報道，不能闡明LncRNA參與糖尿病腎病的發(fā)病機制，更無法了解其在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的重要地位。

利用腎臟病特色生物樣本庫，通過高通量芯片Arraystar人類LncRNA芯片V3.0分別對糖尿病腎病患者（經(jīng)腎穿刺活檢確定）血、尿、腎組織標本進行篩選，并與正常對照組進行比較，初步得到差異表達的LncRNA譜。在LncRNA芯片篩選的結(jié)果中，實驗發(fā)現(xiàn) LncRNADLX6-AS1（DLX6 antisense RNA 1：RefSeq Gene ID 285987，對應于小鼠的是Dlx6-os1）在糖尿病腎病患者體內(nèi)的表達水平較正常對照組明顯增多，并且與糖尿病腎病患者尿蛋白水平成正相關。進一步通過糖尿病腎病動物模型dbdb小鼠和stz誘導的糖尿病模型小鼠進行驗證，發(fā)現(xiàn) DLX6-os1的表達水平與小鼠的尿蛋白的增加成正相關。說明lncRNA DLX6-os1與糖尿病腎病腎臟損傷密切相關，但具體的機制和作用不明。

進一步實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-os1在不同的組織器官中表達水平不同，發(fā)揮的作用機制也有所不同。為了進一步明確該lncRNA在不同器官中的重要作用，需要改變實驗動物不同組織器官的DLX6-os1的表達水平。目前國際普遍應用的方法是注射攜帶lncRNA的病毒到相應的組織器官，試圖改變該lncRNA的表達水平，但存在較多問題：1.病毒的感染效率低，不能實現(xiàn)在特定器官中有效改變lncRNA的表達水平的效果。2.有些lncRNA序列較長，不適合包裝病毒或造成病毒的滴度低。3.有些器官不適合進行病毒的感染和注射。

因此，通過基因工程技術對C57小鼠進行基因改造，培育出FLOX-DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠，此小鼠可與多種不同器官帶有cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表達水平的小鼠，這些小鼠可應用于不同的疾病模型中，為明確lncRNA DLX6-os1在不同組織器官中的作用提供了非常好的動物模型，有效解決適用于不同組織器官中研究該lncRNA的作用問題，但至今未見有公開報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠的培育方法，可有效解決作為動物模型，適用于不同組織器官中研究該lncRNA的作用問題。

本發(fā)明解決的技術方案是，一種條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠的培育方法，通過基因工程技術對C57小鼠進行基因改造，構建出FLOX-DLX6-os1轉(zhuǎn)基因小鼠，此小鼠可與多種不同器官帶有cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到在不同器官中降低DLX-os1表達水平的小鼠，具體是：

1、構建載體