[發明專利]條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法

在審

• 申請號: 201910444912.0
• 申請日: 2019-05-27
• 公開（公告）號: CN110117616A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 郭佳;劉章鎖;余樸;龔如軍;劉東偉;喬潁進;潘少康;周思捷;周夢文;雷敏;劉勇;鄭文;楊圓圓
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法，其特征在于，通過基因工程技術對C57小鼠進行基因改造，構建出FLOX-DLX6-os1轉基因小鼠，此小鼠可與多種不同器官帶有cre酶的轉基因小鼠雜交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表達水平的小鼠，具體是：

（1）、構建載體

構建Dlx6-os1條件敲除載體，Dlx6-os1基因，轉錄物：Dlx6-os1-201ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6號染色體上的三個外顯子，以三個外顯子作為條件敲除區域，刪除該區域應導致小鼠Dlx6-os1基因功能喪失；

將C57BL / 6小鼠基因文庫中RP24-276P7 and RP24-260F14的BAC克隆作為模板，進行PCR，獲得試驗所需要的目的載體及敲除區域；

在目的載體中，Neo位點旁插入自刪除錨定位點，基因敲除區域旁插入loxp位點，DTA用于陰性選擇；

與Cre酶介導的基因重組后，得構建成功的基因敲除質粒載體；

（2）、基因動物打靶培育：

將C57bl/6 ES細胞用于基因打靶，也就是將基因敲除質粒載體導入ES細胞中，進行后續繁育，與多種不同器官帶有Cre酶的轉基因小鼠雜交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表達水平的陽性小鼠。

2.根據權利要求1所述的條件性敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、構建載體

為了在C57BL / 6小鼠中創建小鼠Dlx6-os1條件敲除模型，首先構建Dlx6-os1條件敲除載體，Dlx6-os1基因，轉錄物：Dlx6-os1-201 ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6號染色體上的三個外顯子，以三個外顯子作為條件敲除區域，刪除該區域應導致小鼠Dlx6-os1基因功能喪失；

A、用高保真Taq DNA聚合酶從BAC克隆擴增含有同源臂和條件敲除區域的小鼠基因組片段，并將其與下面顯示的重組位點和選擇標記一起依次組裝成靶向載體：

（1）、從BAC DNA中PCR擴增目的片段，電泳檢測擴增產物，切膠回收目的片段；

PCR引物：上游引物No1：GTTATCAGCAAGCAGATTCTCATTG

下游引物No1：GACTCACCATCTGAAACTGTAATCA

目的片段序列為SEQ ID No：1；

（2）、目的片段與基本載體連接；

（3）、連接產物轉化感受態，涂平板過夜培養；

（4）、挑取單菌落，菌落PCR篩選陽性克隆；

PCR引物序列：上游引物No2：CAAGTGAAGTTCTGGGCGAGTCT

下游引物No2：CTTTTGCTGTGTTCACCAAGCCTT

（5）、菌落PCR陽性克隆小提質粒，進行酶切鑒定；

（6）、酶切鑒定的陽性克隆進行測序驗證；

測序引物序列：上游引物No3：CTATGACTAAGGGCTCTAACTATCTC

下游引物No3：TGAGATGCTTGGCCGAGTGTTCAGT

（7）、測序：對引物進行測序，測序正確，證明目的片段已成功連接入基本載體，保存陽性克隆菌株，質粒用于連接其余片段；

（8）、目的片段連接完成，獲得最終載體，進行后續質粒制備及線性化；

B、質粒制備：

（1）、將前述連接目的片段的最終載體質粒轉化大腸桿菌；

（2）、搖菌提取質粒；

（3）、MN質粒純化試劑盒純化質粒并用超純水溶解；

（4）、酶切驗證質粒，進行質粒線性化；；

（5）、酶切驗證線性化質粒；

（6）、電泳線性化質粒，切膠回收目的片段；

（7）、酶切驗證回收的線性化產物；

（8）、線性化載體質粒，用于后續ES細胞打靶；

在靶向載體中，Neo盒側翼為自身缺失錨位點，條件敲除區域側翼為loxP位點，DTA用于陰性選擇；在Cre介導的重組后將獲得組成型KO等位基因，載體構建成功后將用于C57BL /6 ES細胞的基因動物打靶培育；

二、基因動物打靶培育：

將靶向的ES 細胞克隆6F4 注射到C57BL/6 白化胚胎中，然后將其重新植入CD-1 假妊娠雌性中，通過其毛色辨別親本，用C57BL/6 雌性育種并隨后對后代進行基因分型確認種系傳遞：

A、ES打靶-電轉

（1）、培養ES細胞；

（2）、胰酶消化，進行細胞計數，確定細胞量足夠電轉；

（3）、離心收集細胞，加入電轉緩沖液和線性化質粒DNA，冰浴片刻，將混合物加入電轉杯進行電轉；

（4）、電轉后冰浴片刻，接種與ES培養基中；

（5）、培養過夜，次日加藥，進行抗藥性篩選；

（6）、繼續培養，待細胞生長穩定后，挑單克隆于96孔板；

（7）、將96孔板ES細胞轉移至新的96孔板，傳代培養；

（8）、細胞生長穩定后，96孔板細胞送檢PCR，做初次打靶篩選；同時，備份板于-80℃保存；

B、ES打靶-PCR篩選：

（1）、SDS裂解液和蛋白酶K混合液裂解96孔板ES細胞，過夜裂解；

（2）、次日，用無水冰乙醇和氯化鈉混合液沉淀基因組DNA；

（3）、質量濃度70%乙醇清洗沉淀，去除殘留乙醇，加入RNAaseA 和注射水混合液，封口37℃培養箱過夜，作為PCR模板；

（4）、準備96孔PCR板，進行PCR擴增及電泳檢測；

PCR引物：

5’arm-F (P1): 5’-CTACTAGCCACATGCTTCTCTTGTGAGG-3’

5’arm-R (P2): 5’-TCGAACTTGTGGCCGTTTACGTG-3’

野生型: N.A.；

基因敲除:～2.7 kb；

Distal loxP PCR:

Distal-loxP-F (P3): 5’-GCCCCAAACTAGAAATCCCTCATC-3’

Distal-loxP-R (P4): 5’-TTGTATGGAGTTGACCCAAAGGGAG-3’

Wildtype: 238 bp

Targeted: 325 bp；

（5）、電泳完成，記錄檢測結果；

C、ES打靶-細胞復蘇傳代：

（1）、準備細胞復蘇所需試劑及物品；

（2）、取出-80℃凍存的備份板；

（3）、將PCR陽性克隆從96孔板傳代至12孔板；

（4）、12孔板細胞生長穩定后，傳至6cm培養皿；

（5）、再將6cm培養皿細胞傳至10cm培養皿；

（6）、待細胞生長穩定后，消化，離心收集細胞，一部份凍存；一部分送檢SouthernBlot；

D、ES打靶-Southern Blot

（1）、PCR法制備地高辛標記探針；

（2）、ES細胞基因組DNA的抽提；

（3）、基因組DNA酶切，酶切產物進行電泳分離；

（4）、電泳凝膠轉膜，將凝膠上的DNA轉移至尼龍膜；

（5）、紫外交聯固定尼龍膜；

（6）、DNA預雜交；

（7）、預雜交完成后，進行雜交過夜；

（8）、雜交后，進行洗膜和阻斷；

（9）、加入抗體孵育，洗滌緩沖液洗滌后，加入檢測緩沖液平衡；

（10）、將膜放入底物顯色液中，避光顯色，使用碧云天公司顯色試劑盒（C3206

（12）、顯色完成，洗膜緩沖液洗滌，觀察結果；

E、囊胚注射：

（1）、從交配后3.5天的供體母鼠子宮內獲取囊胚；

（2）、安裝顯微注射設備，準備所需試劑及物品；

（3）、挑選形態良好、發育狀態適中的囊胚，轉移至注射皿的培養基內；

（4）、將待注射ES轉移至注射皿的細胞培養基內，使其均勻排列，密度適中；

（5）、將ES細胞吸入注射針，將其逐個注射入囊胚腔；

（6）、注射完成后，可在囊胚腔內看到ES細胞；

F、代孕鼠制備及胚胎移植：

（1）、選取適齡的母鼠與結扎公鼠合籠，獲取代孕母鼠；

（2）、將注射ES細胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宮內；

（3）、將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養；

（4）、囊胚移植完成，待嵌合體小鼠出生；

（5）、嵌合體出生1周后編號,3周后 進行分籠；

G、F1小鼠繁殖：

（1）、雄性嵌合體出生滿8周，與8周齡母鼠，B6或Floxp/Cre工具鼠合籠；

（2）、出生小仔放入新的籠盒，并進行編號；

（3）、待1周齡左右剪小鼠腳趾送檢PCR，進行一次鑒定；

（4）、保留一次鑒定陽性小鼠，待2周齡左右剪鼠尾送檢PCR，進行二次鑒定；

（5）、經2次PCR鑒定陽性的小鼠，為正確打靶的雜合子小鼠，實現條件性敲除lncRNADLX6-os1轉基因小鼠的培育。