[發明專利]一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體、構建篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201910443566.4
• 申請日: 2019-05-27
• 公開（公告）號: CN110184297A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 李華鵬
• 申請（專利權）人: 廣州派真生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C12N7/00
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體及該載體的構建方法、篩選方法和應用；所述載體基于Rep2與CapDJ輔助包裝載體，在CMV啟動子驅動下的miR33?5’UTR和miR33?3’UTR之間插入克隆shRNA的位點2×BsmBI，shRNA表達小片段連接入所述骨架載體的2xBsmBI位點。所述載體的構建方法包括：制備克隆用骨架；制備shRNA表達小片段；將shRNA表達小片段連接至克隆用骨架載體上。所述篩選方法包括：用所述載體轉化Stbl3感受態細菌，質粒提取；將提取的質粒共轉染293T細胞；滴度比較篩選。本發明實現提高AAV生產效率約60％以上。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體及該載體的構建方法、篩選方法和應用。

背景技術

目前基因治療從近幾十年來無數科學家的夢想正逐步變成了現實。基因治療的載體一直是整個基因治療的關鍵，但必須要滿足安全性、有效性、特異性的要求。基因病毒載體在基因治療中發揮著關鍵的作用，目前重組腺相關病毒(rAAV)載體是公認為符合以上三個標準的基因治療載體。但長期以來由于AAV的生產得率提升緩慢，嚴重制約著AAV載體在臨床應用上的普及程度。

隨著第一個被歐盟批準的治療脂肪酸酶缺陷的基因治療藥物Glybera上市，AAV作為基因治療載體的可行性已被證明，但AAV的生產效率仍是基因治療的關鍵瓶頸。通常情況下，一個需要全身性轉導的遺傳疾病需要AAV約1x10¹⁵AAV基因組拷貝數(GC)的顆粒，而這個臨床級別的生產量需要50萬美元。如果用目前實驗室能力范圍內一次50個15cm盤可獲得1x10¹³GC的生產效率來計算，則需要生產100次或100倍的生產規模才能得到治療一個病人的總量。因此，如何提高AAV的產量進而降低臨床費用成為本領域技術人員亟待打破的瓶頸。

目前AAV的主要生產方法是三質粒轉染293T細胞方法。該方法簡單快速，但由于293T為貼壁細胞，其在規模上的擴展困難較大。若能能把貼壁細胞馴化為懸浮細胞，則該方法會成為規模化工業生產的重要候選方案。把貼壁的293T細胞馴化為懸浮細胞近幾年已有人取得成功，但由于生產效率仍不能滿足需求，規模化生產只能靠單一地增加生產規模。因此，在方法上改進、創新，取得更高的AAV產率是目前基因治療的熱點之一。

293細胞作為AAV生產所用的主要宿主細胞，并非天然適合AAV的生產。細胞中的信號通路及各AAV相關的關鍵基因表達和調節也存在很大的優化空間，如Stifani S.等人在2017年所揭示的，某些基因的下調表達可極大促進AAV包裝的效率。因此，高效地篩選發現何種基因的下調表達能促進AAV的表達是一個提高AAV產率的重要的手段。在選擇shRNA表達的方式上，最早期的方式是用Pol III啟動子U6或H1來驅動shRNA的表達，但自2006年始，有報道證明使用Pol II啟動子來驅動表達miRNA骨架上的shRNA更優，比常規的Pol III啟動子驅動shRNA有更高的效率和更低的細胞毒性。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種表達shRNA的載體及該載體的構建方法、篩選方法和應用，所述載體用作shRNA的表達，可以大幅度提高AAV生產效率；所述構建方法、篩選平臺在各環節實現高通量處理，省去各個載體單獨克隆及測序驗證的步驟，從而在得到有效篩選結果的基礎上節省大量資源與人力。

本發明通過以下技術方案實現：

一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體，其結構如圖1所示，其是在Rep2與CapDJ輔助包裝載體中CMV啟動子驅動下的miR33-5’UTR和miR33-3’UTR之間插入克隆shRNA的位點2xBsmBI，將shRNA表達小片段連接入骨架載體的2xBsmBI位點，并以合成的pA終止子終止轉錄，其中miR33-5’UTR的序列如SEQ ID NO:1所示，miR33-3’UTR的序列如SEQ ID NO:2所示。