[發明專利]一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體、構建篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201910443566.4
• 申請日: 2019-05-27
• 公開（公告）號: CN110184297A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 李華鵬
• 申請（專利權）人: 廣州派真生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C12N7/00
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種表達shRNA的AAV輔助包裝載體，其結構如圖1所示，其是在Rep2與CapDJ輔助包裝載體中CMV啟動子驅動下的miR33-5’UTR和miR33-3’UTR之間插入克隆shRNA的位點2xBsmBI，將shRNA表達小片段連接入骨架載體的2xBsmBI位點，并以合成的pA終止子終止轉錄，其中miR33-5’UTR的序列如SEQ ID NO:1所示，miR33-3’UTR的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.權利要求1所述的表達shRNA的AAV輔助包裝載體的構建方法，其特征在于，其步驟包括：

(1)制備線性化粘性末端的克隆用骨架；

(2)合成雙鏈帶粘末端的shRNA表達小片段；

(3)將步驟(2)中雙鏈帶粘末端的shRNA表達小片段連接至步驟(1)中克隆用骨架上。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述表達shRNA的載體的構建方法，具體步驟包括：

(1)用上述含有CMV-miR33-5’UTR-2xBsmBI-3’UTR表達盒的Rep/CapDJ輔助包裝載體作為shRNA表達克隆骨架載體，命名為mRRC，使用BsmBI酶切得到線性化粘性末端的克隆用載體骨架；

(2)合成所需的shRNA的正反鏈引物，分別配成20μM濃度，按體積比正鏈：反鏈：10xT4DNA：滅菌無核酸酶H₂O＝1:1:1:7的配比取正鏈引物、反鏈引物加入10xT4 DNA連接反應緩沖液，并在滅菌無核酸酶H₂O內混勻，95℃變性5分鐘后，以每分鐘5℃的降溫速度退火至常溫，得到雙鏈帶粘末端的shRNA表達小片段；

(3)將步驟(2)中所得的雙鏈帶粘末端的shRNA表達小片段連接到步驟(1)中所得的線性化的骨架載體的2xBsmBI位點：把退火產生的雙鏈帶粘末端的shRNA表達小片段稀釋20倍后，取1μl，再加入25ng mRRC載體骨架、1μl10xT4DNA連接酶反應緩沖液、0.5μlT4 DNA連接酶，用水補充到10μl總體積，16℃下連接16小時；后加1.5μlNEBuffer4(10X)反應緩沖液、1.5μl10mmol/lATP、0.5μlExonuclease V，37℃反應0.5小時，即得表達shRNA的AAV輔助包裝載體。

4.一種權利要求1所述的表達shRNA的AAV輔助包裝載體的篩選方法，其步驟包括：

(1)準備權利要求1所述的載體，或者按權利要求2-4任意一項所述方法驟構建連接表達shRNA的AAV輔助包裝載體；

(2)轉化：用(1)中所述載體轉化Stbl3感受態細菌，培養，取培養菌液作無內毒素小量質粒提取；

(3)轉染：將(2)中小量提取的質粒與Ad輔助質粒pAd-deltaF6、帶ITR目的載體pITR-CAG..Gluc共轉染293T細胞，設未插入shRNA的空載體作為對照樣品，培養；

(4)滴度比較篩選：整板細胞進行凍融，離心，取上清作懸浮感染；然后檢測Gluc酶活性強度，與對照相比量化倍數；確定能提高AAV產量的克隆，保存；后用保存的克隆菌種作平板劃線培養，挑克隆菌測序確定shRNA序列。