[發明專利]一種表達HA基因的重組火雞皰疹病毒及其應用

在審

• 申請號: 201910443329.8
• 申請日: 2019-05-24
• 公開（公告）號: CN110205308A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 謝青梅;封柯宇;申曉晨;藺文成;張新珩;李鴻鑫
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/869;C12N15/44;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種表達禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒及其應用，是以病毒載體HVT?BAC為平臺，聯合使用RED/ET重組技術和ccdB反向篩選技術通過兩步重組法制備而來，其中，HA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其有益效果在于，本發明所使用的HA基因來自我國近年來廣泛流行的H9N2毒株，對禽類具有廣泛的免疫原性，本發明的制備方法實現了外源基因的快速、準確重組，所使用的篩選標記有利于減化篩選步驟，得到的重組病毒株能穩定傳代，用該重組病毒株制備的疫苗可以刺激雞體產生潛伏感染，引起終生免疫，為有效防控H9N2禽流感和馬立克氏病提供技術支持，具有重要的生產指導意義。

技術領域

本發明屬于動物基因工程疫苗技術領域，更具體地，涉及一種表達HA基因的重組火雞皰疹病毒及其應用。

背景技術

目前養禽生產中廣泛使用的H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)全病毒滅活疫苗雖具有良好的免疫效果，但此類疫苗不能誘導有效的細胞免疫應答和黏膜免疫應答，同時受母源抗體的干擾較大。

AIV易發生抗原漂移，并且一般造成病毒的中小型流行，然而抗原變異則極易造成世界性大流行。因此禽流感的防控難點之一就在于AIV的抗原變異。目前常用的診斷方法有病毒分離，血凝試驗和血凝抑制試驗，病毒中和試驗，熒光免疫技術，瓊脂擴散試驗，酶聯免疫吸附試驗，補體結合實驗等等。

HA基因的變異性很強，最能反應出AIV的變異程度。因此在生產中及時準確的掌握HA基因關鍵位點的變異，會對監控AIV的流行情況，選用合適的疫苗進行免疫有指導作用。基于HA基因的活載體疫苗、亞單位疫苗或核酸疫苗均可對同一HA亞型病毒的攻擊產生近100％的保護，但由于HA變異率極高，使得基于該基因的多種疫苗的保護性是具有亞型特異性的，即僅僅局限在與所表達的HA為同一亞型之間的作用，而對其它亞型病毒攻擊的保護性較差。

目前，H9N2亞型AIV滅活苗的使用對于該病的防控與流行起到了重要作用，但是滅活苗不能針對同一亞型的變異株或者不同亞型的變異株產生交叉保護，此類疫苗不能有效誘導細胞免疫和黏膜免疫應答，使用過程中受母源抗體的干擾較大。因此亟須新型疫苗的開發。

發明內容

本發明針對于以上問題，提供一種以HVT病毒為載體，表達H9N2病毒HA抗原基因的病毒株rHVT，所述HA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明還保護上述表達H9N2亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株rHVT的制備方法，所述方法包括以下步驟：

S1：構建火雞皰疹病毒細菌人工染色體質粒pHVT-BAC

將火雞皰疹病毒疫苗株HVT-FC126的基因組DNA通過同源重組的方法插入到BAC載體上得到火雞皰疹病毒載體pHVT-BAC，其中火雞皰疹病毒疫苗株HVT-FC126株全基因組序列參見GenBank登錄號No.AF291866；

S2：HA基因表達盒的擴增

以H9N2亞型禽流感病毒基因組的cDNA為模板，擴增得到5’端帶有同源臂及啟動子，3’端帶有同源臂及poly(A)尾的HA基因表達盒，其中，同源臂為與HVT-FC126插入位點兩端序列同源；

S3：ccdB-amp選擇標記基因表達盒的擴增

以質粒p15A-ccdB-amp為模板，擴增得到兩側帶有同源臂的選擇標記基因ccdB-amp基因表達盒；

S4：構建含有HA基因的重組質粒pHVT-BAC-HA

先利用RED/ET重組將選擇標記基因ccdB-amp表達盒替換HVT US2區，再利用RED/ET重組將HA基因表達盒替換ccdB-amp表達盒，從而得到含有H9N2禽流感HA基因的重組質粒pHVT-BAC-HA；