[發明專利]一種表達HA基因的重組火雞皰疹病毒及其應用

在審

• 申請號: 201910443329.8
• 申請日: 2019-05-24
• 公開（公告）號: CN110205308A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 謝青梅;封柯宇;申曉晨;藺文成;張新珩;李鴻鑫
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/869;C12N15/44;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
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1.一種表達H9N2亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述H9N2亞型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根據權利要求1所述表達H9N2亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述rHVT-HA通過以下方法制備而來：

S 1：構建火雞皰疹病毒細菌人工染色體質粒pHVT-BAC

將火雞皰疹病毒疫苗株HVT-FC126的基因組DNA通過同源重組的方法插入到BAC載體上得到火雞皰疹病毒載體pHVT-BAC，其中火雞皰疹病毒疫苗株HVT-FC126株全基因組序列參見GenBank登錄號No.AF291866；

S2：HA基因表達盒的擴增

以H9N2亞型禽流感病毒基因組的cDNA為模板，擴增得到5’端帶有同源臂及啟動子，3’端帶有同源臂及poly(A)尾的HA基因表達盒，其中，同源臂為與HVT-FC126插入位點兩端序列同源；

S3：ccdB-amp選擇標記基因表達盒的擴增

以質粒p15A-ccdB-amp為模板，擴增得到兩側帶有同源臂的選擇標記基因ccdB-amp基因表達盒；

S4：構建含有HA基因的重組質粒pHVT-BAC-HA

先利用RED/ET重組將選擇標記基因ccdB-amp表達盒替換HVT US2區，再利用RED/ET重組將HA基因表達盒替換ccdB-amp表達盒，從而得到含有H9N2禽流感HA基因的重組質粒pHVT-BAC-HA；

S5：制備表達H9N2禽流感HA基因的火雞皰疹病毒毒株

將重組質粒pHVT-BAC-HA轉染CEF細胞拯救出重組病毒，即獲得表達H9N2禽流感HA基因的火雞皰疹病毒rHVT-HA。

3.根據權利要求2所述表達H9N2亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒株rHVT-HA，其特征在于，所述制備rHVT-HA的方法包括以下步驟：

SS1：含有同源臂的BAC骨架載體的構建；

以提取的HVT感染CEF細胞后的總DNA為PCR模板，分別擴增包含火雞皰疹病毒US2區上、下游同源臂的基因片段，引物如下：

同源臂A上游引物為：FA：5’-AAAATCGATGTAAAGGTTGG-3’；

同源臂A下游引物為：RA：5’-AGTTCTGCAGTACCGGATTTG-3’；

同源臂B上游引物為：FB：5’-GTGTCACGAACTTTACCGAA-3’；

同源臂B下游引物為：RB：5’-GCTTTGTATCTCCAAGAACAC-3’；

將擴增產物同源臂A和同源臂B回收、純化并連接質粒pGEM，得到含有同源臂A和B的質粒pGAB-T；

以質粒pGE-gpt為PCR模板，擴增加壓篩選標記基因gpt表達盒，所用引物如下：

gpt基因上游引物Fgpt：5’-ATGTTAATTAAGAAGCTAGGCGCGCCTGT-3’；

gpt基因上游引物Rgpt：5’-ATGTTAATTAAGGGCCGGCC-3’；

再將gpt表達盒與pGAB-T酶切、連接、轉化得到含有同源臂A和B以及篩選標記基因gpt的載體pGAB-gpt；

提取質粒pBeloBAC11，經Hind III酶切，回收獲得BAC載體片段，將BAC載體片段與載體pGAB-gpt酶切連接、轉化，獲得重組轉移載體pGAB-gpt-BAC11；

取新鮮制備的CEF細胞，接種HVT-FC126病毒，轉染重組轉移載體pGAB-gpt-BAC11；經篩選、純化得到重組病毒rHVT-BAC；

將上述重組病毒rHVT-BAC感染CEF細胞的總DNA電轉到大腸桿菌DH10B感受態細胞，鑒定篩選得到含有HVT全基因組的病毒載體pHVT-BAC；

SS2：含有HA基因的真核表達質粒的構建和HA基因表達盒的擴增；

擴增獲得SEQ ID No.1所示HA基因，將擴增產物HA基因和質粒pcDNA3.1(-)連接后轉化DH5α感受態細胞，篩選得到真核表達質粒pcDNA-HA；

HA基因表達盒的構建；

以pcDNA-HA質粒為模板，擴增得到5’端帶有50bp同源臂及CMV啟動子和3’端帶有50bp同源臂及poly(A)尾的HA基因表達盒，擴增引物如下：

F1：

5’-TTCGCTCGCGCGACTCCATACATTGAATAATTCCACACGTCAGCTCATCTGTTGACATTGATTATTGACT-3’；

R1：

5’-ATGAATGGCAGAAATTCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGTCGAAAGCCATAGAGCCCACCGCATC-3’

SS3：ccdB-amp基因表達盒的擴增；

以p15A-ccdB-amp為模板，擴增兩側帶有50bp同源臂的選擇標記基因ccdB-amp基因表達盒，所用引物如下：

F2：5’-TTTGTTTATTTTTCTAAATAC-3’；

R2：5’-AGCCCCATACGATATAAGTTGT-3’；

SS4：構建含有HA基因的重組質粒pHVT-BAC-HA

利用RED/ET重組將選擇標記基因ccdB-amp表達盒替換HVT US2區：將psc101-ccdA-gbaA質粒，電轉到含pHVT-BAC的DH10B的感受態細胞中，得到包含pHVT-BAC和psc101-ccdA-gbaA質粒的DH10B的感受態細胞；

將擴增回收的ccdB-amp基因表達盒電轉到包含pHVT BAC和psc101-ccdA-gbaA質粒的DH10B的感受態細胞中，得到重組質粒為pHVT-BAC-ccdB-amp-ccdA；

利用RED/ET重組將HA基因表達盒替換在HVT US2區；

將HA基因表達盒電轉進含有重組質粒pHVT-BAC-ccdB-amp-ccdA的感受態細胞中，得到重組質粒pHVT-BAC-HA；

SS5：重組病毒rHVT-HA的拯救：提取重組質粒pHVT-BAC-HA，轉染CEF細胞拯救出重組病毒rHVT-HA。