[發明專利]一種利用三種糖基轉移酶制備Globotriose-連接的活性糖肽的方法

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• 申請號: 201910441804.8
• 申請日: 2019-05-24
• 公開（公告）號: CN110117631A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 陳敏;孔蘊;劉芳
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12P21/02;C07K9/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose?連接活性糖肽的方法，首先是利用N?糖基轉移酶ApNGT將UDP?Glc轉移至含有N?X(X≠P)?T/S糖基化位點的多肽上的Asn氨基酸殘基上，隨后在β?1,4?半乳糖基轉移酶LgtB的作用下合成Peptide?Lactose，然后在α?1,4?半乳糖基轉移酶LgtC的作用下合成產物，再使用高壓液相色譜進行純化，洗脫樣品濃縮，產物冷凍干燥后即獲得具有生物活性的Peptide?globotriose活性糖肽。本發明方法為大量快速的生產多種基于Globotriose的寡糖肽提供了可能，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種活性糖肽的制備方法，尤其涉及一種利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

Globotriose(α-Gal(1→4)β-Gal(1→4)β-Glc，Gb3)是中性糖鞘脂globotrio-神經酰胺(globotriaosylceramide，Gb3-cer)的碳水化合物部分，參與許多重要的生理學過程。Gb3位于細胞膜上，在細胞的生長、分化以及癌癥轉移等方面有著重要的作用。有研究表明Gb3在乳腺癌和淋巴瘤等中過量表達，可以作為一種有效分子標記應用于腫瘤發展過程中。另外，globotriose還是一些腫瘤相關糖抗原如GloboH和SSEA4糖鏈的核心結構，而這些糖抗原與人類的肺癌、腦癌的產生與發展存在著千絲萬縷的聯系，因此globotriose可在癌癥疫苗的開發研究過程中扮演相關腫瘤糖抗原的合成前體進行應用。同時病原菌O157:H7的志賀氏毒素(Stx)也是通過與腸道細胞表面的Globotriose結合引起痢疾甚至致命性綜合尿毒癥(HUS)，這使得Globotriose可以被用來抵抗志賀氏毒素Stx感染。近年還有文獻證實Globotriose在細胞表面的表達量與機體對HIV-1的抵抗性呈現相關性。過去Globotriose大部分是以寡糖的形式進行利用，但是將寡糖鏈與多肽相連接形成糖肽后，多肽可以作為一種特殊的骨架以輔助改善寡糖鏈的生物相容性、提高對一些水解酶的抗性等，明顯提升了Globotriose的作用。因此活性糖肽的合成制備及重要生物學功能的研究具有廣泛意義。

糖肽合成技術的發展可以有效地幫助科學家解決在探索糖蛋白科學領域時遇到的棘手問題。最早的活性糖肽制備使用化學法進行合成，存在產率低、副產物積累較多等缺點。目前使用酶法合成糖肽因其步驟簡便、且酶催化合成的糖肽鍵具有良好的立體及區域選擇性而被廣泛關注和應用。然而，初期使用的空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的N-糖基化系統(Pgl)在大腸桿菌中合成糖綴合物，還是產率非常低，無法滿足科研和生產需求。近期檢索發現，有關利用多種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法還未見報道。

發明內容

針對現有活性糖肽合成方法產率低、副產物多等不足，本發明要解決的問題是提供一種利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法。

本發明所述的利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，步驟是：

(1)以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位點的多肽為起始底物，利用N-糖基轉移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽；

(2)以獲得的Peptide-Glc活性糖肽，利用β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽；

(3)以獲得的Peptide-Glc-Gal活性糖肽，利用α-1,4-半乳糖基轉移酶LgtC合成制得Peptide-globotriose活性糖肽。