[發明專利]一種利用三種糖基轉移酶制備Globotriose-連接的活性糖肽的方法

在審

• 申請號: 201910441804.8
• 申請日: 2019-05-24
• 公開（公告）號: CN110117631A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 陳敏;孔蘊;劉芳
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12P21/02;C07K9/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，步驟是：

(1)以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位點的多肽為起始底物，利用N-糖基轉移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽；

(2)以獲得的Peptide-Glc活性糖肽，利用β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽；

(3)以獲得的Peptide-Glc-Gal活性糖肽，利用α-1,4-半乳糖基轉移酶LgtC合成制得Peptide-globotriose活性糖肽。

2.根據權利要求1所述利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，其特征在于：所述含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位點的多肽選多肽DANYTK、多肽WPAVGNCSSALRW、多肽KYPALNVTMPN或多肽VLRVANITRLQ。

3.根據權利要求1所述利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，其特征在于：所述的N-糖基轉移酶ApNGT來自Actinobacilluspleuropneumoniae；所述的β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB來自Neisseria meningitidesMC58；所述的α-1,4-半乳糖基轉移酶LgtC來自Neisseria meningitides MC58。

4.根據權利要求1所述利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，其特征在于：步驟(1)所述利用N-糖基轉移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽的步驟是：

1)按照終濃度計，以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位點的多肽0.8～1.0mM，UDP-Glc8～10mM，pH 7.0～8.0的10～300mM HEPES緩沖液為反應體系，加入2～5mg/mL的N-糖基轉移酶ApNGT；

2)置30-37℃水浴條件下，反應時間5～50h；

3)將反應后的混合液100℃處理5～8min終止反應，然后以12000r/min離心5～15min取反應上清液使用高效液相色譜(HPLC)按常規方式進行分析和純化，洗脫樣品使用旋轉蒸發儀進行濃縮，產物冷凍干燥后即得Peptide-Glc活性糖肽。

5.根據權利要求4所述利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，其特征在于：

步驟1)中，按照終濃度計，含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位點的多肽1.0mM，UDP-Glc10mM，pH8.0的10mM HEPES緩沖液為反應體系，加入4mg/mL的N-糖基轉移酶ApNGT；

步驟2)中，所述水浴選30℃，反應時間選30h。

6.根據權利要求1所述利用三種糖基轉移酶分步合成法制備含有Globotriose-連接活性糖肽的方法，其特征在于：步驟(2)所述利用β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽的步驟是：

1)以制得的Peptide-Glc活性糖肽0.8～1.0mM，UDP-Gal 8～10mM，pH7.0～8.0的10～300mM HEPES緩沖液為反應體系，加入0.2～0.5mg/mL的β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB；

2)置30-37℃水浴條件下，反應時間5～50h；

3)將反應后的混合液100℃處理5～8min終止反應，然后以12000r/min離心5～15min取反應上清液使用高效液相色譜(HPLC)按常規方式進行分析和純化，洗脫樣品使用旋轉蒸發儀進行濃縮，產物冷凍干燥后即得Peptide-Glc-Gal活性糖肽。