[發明專利]檢測獼猴血漿中中期因子反義寡核苷酸含量的方法

有效

• 申請號: 201910432682.6
• 申請日: 2019-05-23
• 公開（公告）號: CN110346493B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 車津晶;原梅;朱小雨;張小差;劉作鋒
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張敏

本發明公開了一種檢測獼猴血漿中中期因子反義寡核苷酸含量的方法，包括：取含有中期因子反義寡核苷酸的待測獼猴血漿，向所述獼猴血漿中加入流感泰德作為內標液，再加入適量氨水溶液、苯酚/二氯甲烷混合液，然后依次進行渦流后離心，以便得到處理后血樣；取所述血樣的上清液并進行LC/MS/MS分析；繪制標準曲線，并根據標準曲線法對所述待測獼猴血漿中所述中期因子反義寡核苷酸的含量進行定量分析。該方法具有專屬性高，并且準確度、精密度、回收率和樣品凍融穩定性等參數均符合檢測要求。

技術領域

本發明屬于藥物分析領域，具體而言，本發明涉及檢測獼猴血漿中中期因子反義寡核苷酸含量的方法。

背景技術

直接利用外來核酸片段干預致病性RNA是非常重要的一大類基因治療策略，在近40年里已發展出多種功能核酸作為這種基因治療策略的候選結構，包括反義核酸、核酶、脫氧核酶、小干擾RNA(siRNA)和miRNA等。它們在抗腫瘤、抗感染、心血管系統疾病、神經系統疾病、代謝失調、炎癥、免疫治療，以及傳統的小分子藥物無法發揮治療作用的疾病和罕見病等治療中已顯示出巨大的應用潛力。

對于很多疾病的致病基因，體外合成的核酸藥物是一種不錯的選擇。隨著分子生物學的發展，人們對疾病相關的基因網絡調控和相關功能蛋白會有更多的了解，尤其是各種內源性核酸對于基因轉錄和表達的自有調控系統，有利于選擇關鍵的致病基因作為基因治療的靶標和合適的基因治療方案，包括利用基因編輯技術實施置換或消除致病基因；利用反義核酸剪切或封閉其表達，或調控外顯子跳躍和剪接，達到下調或上調功能蛋白表達的目的；采用siRNA和核酶方法降解靶RNA；針對miRNA網絡來調控靶RNA的表達。所以，針對一種或一類疾病的相關基因突變，可以有多種候選方法，這是基因治療的一大優點。處于臨床前和臨床試驗中的核酸藥物先后達到數百種之多，但因核酸結構離成藥性要求相去甚遠(極性大分子、帶多個負電荷、易于被核酸酶降解和被肝腎清除、免疫原性和轉運困難等)，在研發過程中遭遇了極大的挑戰。而化學修飾在核酸藥物的成藥性優化策略中發揮了巨大作用，并已取得了相當大的成效。在經歷了第1代、第2代和第2.5代的進步，獲得的一個重要經驗是一種化學修飾不可能解決所有問題，多個修飾的組合是最有效的解決途徑，也是目前所有核酸藥物所采取的修飾方式。當然，核酸藥物的種類和作用機制對修飾的方式和位點的選擇具有重要意義。

經過近40年的發展，從已成功用于臨床治療的反義藥物到充滿希望的siRNA藥物，核酸藥物在化學修飾、轉運載體、序列依賴性和非依賴性的藥學性質、體內外評價方法等方面積累了豐富的經驗。為今后擴大基因治療范圍，開發更多核酸藥物提供了理論基礎和實踐經驗。因此，期待中國大力開展核酸藥物的基礎研究和應用開發，尤其是在核酸藥物的創新性優化研究上，取得更多知識產權，在未來核酸基因藥物的巨大應用市場研發中占有一席之地。

反義核酸類藥物與內源性物質的相似性和分子質量大等特點。因此，反義核酸類藥物藥物代謝動力學研究方法和技術所面臨的最大挑戰是如何高效地從生物基質中萃取、富集和識別藥物和避免內源性物質干擾，并準確鑒別和定量分析反義核酸類藥物。目前，放射性同位素示蹤技術、高效液相色譜、高效薄層色譜、毛細管電泳和質譜等用于反義核酸類藥物的藥物分析。但是對于生物基質(血、尿、糞便等)中的反義寡核苷酸的定量分析鮮有報道。僅用毛細管電泳檢測方法報道，毛細管電泳法是包含電泳、色譜及其交叉內容。該方法特異性較差，靈敏度不高。為了克服以上局限性，必須發展替代性的生物基質中反義核酸類藥物定量分析方法以滿足對反義核酸類藥物進行準確度高、特異性強、靈敏度高地生物基質樣本中的定量分析的要求。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種檢測獼猴血漿中中期因子反義寡核苷酸含量的方法，該方法具有專屬性高，并且準確度、精密度、回收率和樣品凍融穩定性等參數均符合檢測要求。

根據本發明的一個方面，本發明提出了檢測獼猴血漿中中期因子反義寡核苷酸含量的方法，根據本發明的實施例，該方法包括：