[發明專利]一種新孢子蟲NcMIC26抗原及其應用有效
| 申請號： | 201910422519.1 | 申請日： | 2019-05-21 |
| 公開（公告）號： | CN110183527B | 公開（公告）日： | 2021-03-12 |
| 發明（設計）人： | 劉晶;王先梅;劉群;許建海 | 申請（專利權）人： | 中國農業大學 |
| 主分類號： | C07K14/44 | 分類號： | C07K14/44;C12N15/30;C12N15/70;A61P33/02;G01N33/531;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279 | 代理人： | 王芊雨;張鵬 |
| 地址： | 100083 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 孢子 ncmic26 抗原 及其 應用 | ||
1.一種新孢子蟲NcMIC26抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種編碼權利要求1所述的新孢子蟲NcMIC26抗原的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一種如權利要求1所述的新孢子蟲NcMIC26抗原在制備治療、診斷或預防新孢子蟲病的產品中的應用。
5.一種如權利要求2或3所述的基因在制備治療、診斷或預防新孢子蟲病的產品中的應用。
6.一種新孢子蟲間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒中包括氨基酸序列如SEQID NO.1所示的重組蛋白rNcMIC26。
7.根據權利要求6所述的新孢子蟲間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于，所述重組蛋白rNcMIC26的制備方法包括如下步驟：
1)設計引物F和R：
F：5’-AGCAAATGGGTCGC
R：5’-TCGAGTGCGGCCGC
2)以新孢子蟲的cDNA為模板利用引物F和R進行PCR擴增，得到目的片段；
3)將目的片段與載體pET-28a進行連接，將連接產物轉化至大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，獲得重組原核表達質粒pET-28a-MIC26；
4)將構建好的重組原核表達質粒pET-28a-MIC26轉化至大腸桿菌Transetta感受態細胞，誘導重組蛋白的表達，收集并純化得到重組蛋白rNcMIC26。
8.根據權利要求6所述的新孢子蟲間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括HRP標記的檢測抗體、包被液、封閉液、抗體稀釋液、洗滌液、底物溶液、終止液、新孢子蟲陽性血清、陰性血清。
9.根據權利要求8所述的新孢子蟲間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于，所述HRP標記的檢測抗體為HRP標記的羊抗牛抗體；所述包被液為0.05M的pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為5％馬血清-PBST；所述抗體稀釋液為2％馬血清-PBST；所述洗滌液為0.5％PBST；所述底物溶液為TMB底物液A、底物液B；所述終止液為2M濃硫酸。
10.一種如權利要求6-9任一所述的新孢子蟲間接ELISA診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：
a)抗原包被：將重組蛋白rNcMIC26用0.05M的pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至10μg/mL，包被條件為37℃1h后，4℃放置14～16h；
b)洗滌：將孔內液體棄掉，加入300μL的0.5％PBST洗滌4次，每次間隔5min；
c)封閉：封閉液使用5％馬血清-PBST，每孔100μL，37℃封閉1h；
d)洗滌：操作步驟同b)；
e)一抗孵育：2％馬血清-PBST溶液1：200稀釋牛待檢血清，每孔100μL，每板設置標準牛新孢子蟲陽性血清、陰性血清作為陽性陰性對照；37℃孵育1h；
f)洗滌：操作步驟同b)；
g)二抗孵育：用2％馬血清-PBST溶液稀釋HRP標記的羊抗牛抗體1：25000稀釋，每孔100μL，37℃孵育0.5h；
h)洗滌：操作步驟同b)；
i)顯色：TMB底物液A、底物液B按照1：1的比例混合，每孔100μL，室溫顯色10min；
j)終止：每孔2M濃硫酸終止反應，每孔50μL；反應結束后在酶標儀上讀取每孔雙波長OD450/630nm值；
h)結果判定：當待檢血清樣本ELISA的OD450/630nm值≥0.165時，可在99.9％的水平上判定為陽性結果。
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