[發明專利]NPM1基因突變分型檢測方法及試劑盒在審
| 申請號: | 201910421885.5 | 申請日: | 2016-07-08 |
| 公開(公告)號: | CN110408697A | 公開(公告)日: | 2019-11-05 |
| 發明(設計)人: | 蔣析文;劉悅 | 申請(專利權)人: | 中山大學達安基因股份有限公司 |
| 主分類號: | C12Q1/6886 | 分類號: | C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司: | 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328 | 代理人: | 陳詳 |
| 地址: | 510665 廣東省廣*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 試劑盒 突變 急性髓性白血病 分型檢測 引物探針混合液 預估 實時熒光PCR 試劑盒應用 特異性探針 外顯子突變 外周血樣本 反應模式 化療效果 患者骨髓 控制系統 快速檢測 通道信號 樣本提取 包裝盒 可檢測 試劑瓶 一步法 分型 檢出 內標 分隔 應用 | ||
本發明提供了NPM1基因突變分型檢測方法及試劑盒。本試劑盒主要包括RT?PCR反應液、引物探針混合液、RT?PCR反應酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒應用一步法實時熒光PCR反應模式,并對特異性探針進行LNA修飾,能超敏快速檢測急性髓性白血病患者骨髓及外周血樣本中的NPM1基因12外顯子突變,最低檢出量為0.2ng,同時根據不同通道信號值可對A型、B型、D型突變進行分型,同時加入內標控制系統可檢測樣本提取效果,可廣泛應用于急性髓性白血病化療效果的預估。
本申請是申請日為2016年07月08日,申請號為201610549977.8,發明創造名稱為“一種檢測NPM1基因突變分型的試劑盒”的發明專利申請的分案申請。
技術領域
本發明涉及一種檢測NPM1基因突變核酸的超敏分型試劑盒,特別是涉及一種利用多重實時熒光聚合酶鏈式反應技術及鎖核酸修飾探針一管反應即可同時檢測NPM1基因突變A型、B型、D型的試劑盒。
背景技術
急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性血液疾病,以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細胞異常增生為主要特征,臨床以低熱、代謝異常貧血、出血、感染和臟器的白血病細胞浸潤為主要特點。流行病學調查顯示,AML是最常見的成人急性白血病,年發生率為3/100000左右。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)是位于核仁顆粒區的主要蛋白分子之一,定位于第5號染色體長臂上(5q35),廣泛地表達于各種類型的細胞。NPM1高表達于增殖活躍的細胞包括腫瘤細胞和干細胞,在腫瘤形成過程中發揮重要作用。NPM1突變,目前已發現約50余種變異體,最常見的類型為12號外顯子發生四個堿基的重復導致蛋白C端結構改變,最頻繁的為突變A,占77%-80%病例,在野生型NPM1核苷酸序列的956~959位置上插入TCTG四個核苷酸重復構成。此外,突變B、D分別占10%、5%,分別是在相同的基因位點插入CATG、CCTG四個核苷酸。
根據美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network)2016年發補的NCCN臨床實踐指南:急性髓性白血病(2016.V1)中明確顯示NPM1突變是預后良好的指標,并不能受益于異基因造血干細胞移植。因此對NPM1突變的檢測是明確AML病患是否進行骨髓移植的重要決定因素。
目前檢測NPM1突變的方法包括:Sanger測序法、CAPs法、RT-qPCR等。Sanger測序法又稱一代測序法,應用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑(雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團,所以可被用作鏈終止試劑)通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法,是為核酸檢測的金標準,但其缺點也較為明確:靈敏度低、操作繁瑣、容易污染。CAPs又稱限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應,基本原理是用PCR擴增目的DNA,擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段,直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同,產生不同長度的DNA片段條帶,此方法不需要成本較低且判讀簡單,但操作繁瑣且靈敏度低。RT-qPCR又稱一步法逆轉錄熒光定量PCR法,將逆轉錄與熒光定量PCR通過溫度的調整達到一步完成的技術,操作過程閉管進行,不會造成樣本污染,同時檢測靈敏度高,應用范圍廣,但檢測位點需明確突變類型。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用多重實時熒光聚合酶鏈式反應技術對NPM1基因突變進行分型的高靈敏度試劑盒,利用本試劑盒可以準確檢測NPM1基因A型、B型、D型突變。
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