[發明專利]促進牛體外胚胎培養受精卵發育的方法

在審

• 申請號: 201910421471.2
• 申請日: 2019-05-21
• 公開（公告）號: CN110066763A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 王小武;郭晶;王娜;郝少強;趙明禮;張月橋;楊尚斌;何偉;馬毅;郭春明
• 申請（專利權）人: 天津博裕力牧科技有限公司;天津中科博雅生物育種研究有限公司;天津力牧鼎豐生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/075
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種胚胎培養液，其是包含：109.5mM氯化鈉、3.1mM氯化鉀、26.2mM碳酸氫鈉、0.8mM六水氯化鎂、1.19mM磷酸二氫鉀、0.4mM丙酮酸鈉、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸鈣、2.5v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸櫞酸鈉0.04w/v％、麥芽糖0.02w/v％的水溶液；所述必需氨基酸為以下氨基酸按重量比例添加：L-鹽酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g、L-鹽酸組氨酸一水物2.1g、L-異亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-蘇氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-纈氨酸2.34g，所述非必須氨基酸為以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天門冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-絲氨酸1.05g。

2.根據權利要求的胚胎培養液，其是包含：109.5mM氯化鈉、3.1mM氯化鉀、26.2mM碳酸氫鈉、0.8mM六水氯化鎂、1.19mM磷酸二氫鉀、0.4mM丙酮酸鈉、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸鈣、2.5v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸櫞酸鈉0.04w/v％、麥芽糖0.02w/v％、0.002～0.005w/v％(例如0.003w/v％)β-胡蘿卜素、0.01～0.02w/v％(例如0.015w/v％)抗壞血酸的水溶液；所述必需氨基酸為以下氨基酸按重量比例添加：L-鹽酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g、L-鹽酸組氨酸一水物2.1g、L-異亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-蘇氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-纈氨酸2.34g，所述非必須氨基酸為以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天門冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-絲氨酸1.05g。

3.牛體外受精胚胎培養的方法，其包括如下步驟：

(1)卵母細胞的采集和體外成熟

離體采集：取屠宰場卵巢盛放于加雙抗生理鹽水的保溫桶中，30.5-33℃條件下，4h內運回實驗室；抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在體視顯微鏡下撿出至少含有3層卵丘細胞包裹的卵母細胞COCs即卵丘-卵母細胞復合體，在洗卵液中洗滌2遍，去除多余雜質；

活體采集：對牛進行活體采卵，將所得卵泡液在體視顯微鏡下撿出至少含3層卵丘細胞包裹的卵丘-卵母細胞復合體，放入包含HEPES的成熟培養液中38.8℃、3h內運回實驗室；

將以上離體采集或者活體采集所得COCs在卵母細胞成熟培養液中洗滌1次，再轉移到新的成熟培養液中培養22-24h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5％CO2、飽和濕度；

(2)體外受精

將成熟的COCs在受精培養液中洗滌1次，再轉移到受精培養液中，放入培養箱中，備用；

從液氮中取一支凍精細管，37℃水浴解凍；無菌操作剪開細管兩端，使精液注入盛有精液制備培養液的15mL離心管中，328×g離心2次，每次5min，離心后棄上清；將300μL精液制備培養液加入上述離心管，重懸精子沉淀，取適當的精子懸液進行精子計數；

將計算好體積的精子懸液加入盛有卵母細胞的受精培養液滴中，并將培養盤放入培養箱，使精卵共孵育16-20h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5％CO2、飽和濕度；

(3)胚胎體外培養及保存

體外受精操作完畢后，將胚胎周圍的顆粒細胞用剝卵針去除干凈，放入胚胎培養液中培養，此時記為胚胎培養的第1天，培養條件為38.8℃、6％O2、88％N2、飽和濕度，第3天記錄卵裂率和8-16細胞率；第7天記錄囊胚率，至第9天時統計囊胚孵化率，并進行質量鑒定；

將可用胚胎在保存液中洗滌3次，在平衡液中平衡10min后轉移入冷凍液，按5段裝液法裝入胚胎，做好標記，再放入程序降溫儀中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，將胚胎細管迅速取出，置入液氮中冷凍保存。