[發明專利]一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法

在審

• 申請號: 201910421000.1
• 申請日: 2019-05-13
• 公開（公告）號: CN110438143A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 童望宇;李梅莉
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/77;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/19;C12R1/15;C12R1/865
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1.一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因組中含有1個I-B-Svi型CRISPR-Cas系統，原始SviCas3因氨基酸序列改變而導致核酸內切酶活性缺失的工程蛋白dSviCas3(defective SviCas3)(蛋白序列見附表)結合含有與目標基因特定序列互補的靶向DNA(guide-DNA/g-DNA)或模板DNA(template DNA/t-DNA)可對生物體基因組中的基因轉錄進行有效調控。

2.根據權利要求1所述的一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：

(1)調控載體的構建

根據dSviCas3氨基酸序列，化學合成相應細胞的堿基優化的基因dSvicas3；結合t-DNA、g-DNA和表達載體DNA序列設計并合成引物；通過PCR擴增及連接酶分別將dSvicas3和t-DNA/g-DNA與表達載體連接(或全化學合成)得到表達蛋白的調控載體Vector_i-dSvicas3-t/g-DNA。

(2)基因轉錄調控轉化子的獲取與檢驗

通過化轉、轉染或電轉化的方法，將按步驟(1)得到的蛋白表達調控載體Vector_i-dSvicas3-g-DNA導入生物細胞中，選擇培養得到候選的基因轉錄調控轉化子；對候選轉化子進行功能鑒定、靶序列PCR及測序分析，得到正確的基因轉錄調控轉化子。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：所述的氨基酸序列改變而導致核酸內切酶活性缺失的工程蛋白dSviCas3指原始SviCas3氨基酸序列的添加、缺失或替換而喪失對靶DNA序列切割功能的蛋白質(與SviCas3具有50％以上的氨基酸序列一致性)。

4.根據權利要求1或2所述的一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：所述的合成相應細胞的堿基優化的dSvicas3序列指根據dSviCas3氨基酸序列而優化的適合于在不同細胞中表達的DNA序列。

5.根據權利要求1或2所述的一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：所述的基因轉錄調控轉化子指因基因轉錄水平的調控而導致靶蛋白表達水平的上調、下調或不表達，進而宿主細胞的表觀、功能及生理發生變化的轉化子。

6.根據權利要求1或2所述的一種基于dSviCas3的基因轉錄調控方法，其特征在于：所述的生物體指原核及真核生物中的任何一種，如：大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、人胚腎細胞等。