[發明專利]一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法

在審

• 申請號: 201910420998.3
• 申請日: 2019-05-13
• 公開（公告）號: CN110438141A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 童望宇;種法根;劉青陽
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/77;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/19;C12R1/15;C12R1/865
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本發明公開了一種基于SviCas6?SviCas3的基因編輯方法。應用SviCas6與SviCas3結合t?DNA和g?DNA，首次實現了SviCas6?SviCas3對生物細胞基因組的基因編輯，也為基于CRISPR?Cas系統進行的基因編輯提供了新的補充和多樣性的選擇。該系統可對原核和真核生物基因組中基因進行有效的、準確的、穩定的基因編輯，可望應用于許多與生物技術相關的領域中。

本發明涉及生物技術中的基因工程領域，確切地說是一種源于維吉尼亞鏈霉菌IBL14的I-B-Svi型CRISPR-Cas系統中SviCas6與SviCas3的基因編輯方法。

背景技術

本質上，基因編輯就是通過工程設計所需功能的模板DNA(template DNA/t-DNA)，通過導向專一性的限制性內切酶對基因組中的DNA進行切割，進而利用細胞自身的同源修復(homology directed repair/HDR)機制達到基因編輯的目的[Giedrius Gasiunas，Tomas Sinkunas，and Virginijus Siksnys(2014)Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity.Cell Mol Life Sci 71，449-465，doi：10.1007/s00018-013-1438-6]。導向專一性的限制性內切酶的導向機制可分為三個水平：(1)蛋白質導向，如：鋅指核酸內切酶(zinc-finger nucleases/ZFN)；(2)RNA導向，如CRISPR-Cas系統；和(3)DNA導向，如我們發現的SviCas3導向[童望宇，唐嚴嚴，夏婷婷(20170919)一種基于I-B型CRISPR-Cas系統基因cas3的基因編輯方法，申請號：201710847193.8.]。與蛋白質導向相比，RNA導向因其成本低、簡便、快捷、高效已廣泛應用于生物、醫藥、農業及食品等領域。

基于原核生物細胞免疫中Cas效應物的組成與結構，CRISPR-Cas系統現分為2類六型[Eugene V Koonin，Kira S Makarova and Feng Zhang(2017)Diversity，classification and evolution of CRISPR-Cas systems.Current opinion inmicrobiology 37，67-78，doi：10.1016/j.mib.2017.05.008]。而1類I型最為廣泛，占已鑒定的細胞基因組的60％以上。眾所周知，在1類I型CRISPR-Cas系統中，由Cse1，Cse2，Cas5，Cas6，Cas7等蛋白組成的Cascade是細胞免疫必需的功能復合體，其中Cas6執行crRNA與發夾結構的加工形成功能[Yibei Xiao，Min Luo，Adam E.Dolan，Maofu Liao，Ailong Ke(2018).Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade andCas3.Science(New York，N.Y.)361，doi：10.1126/science.aat0839；PrarthanaMohanraju，Kira S.Makarova，Bernd Zetsche，Feng Zhang，Eugene V.Koonin，John vander Oost(2016)Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of theCRISPR-Cas systems.Science(New York，N.Y.)353，aad5147，doi：10.1126/science.aad5147]。