[發明專利]一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法

在審

• 申請號: 201910420998.3
• 申請日: 2019-05-13
• 公開（公告）號: CN110438141A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 童望宇;種法根;劉青陽
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/77;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/19;C12R1/15;C12R1/865
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1.一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因組中含有一個I-B-Svi型CRISPR-Cas系統，該系統中的蛋白質SviCas6和SviCas3(氨基酸序列見附表)結合模板t-DNA(template DNA)和靶向g-DNA(guide-DNA)可對生物細胞基因組中的基因進行有效編輯。

2.根據權利要求1所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于，包括編輯工具的構建及重組子的構建與檢驗步驟如下：

(1)編輯載體的構建

根據SviCas6和SviCas3氨基酸序列，合成相應生物細胞的堿基優化的DNA序列，并結合t-DNA、g-DNA及表達載體DNA序列設計引物，經引物合成、PCR擴增、限制性酶切割及連接酶連接，分別將蛋白編碼基因、t-DNA、g-DNA和表達載體連接得到蛋白SviCas6-SviCas3表達的基因編輯工具Vector-cas6-3-t/g-DNA。

(2)重組子的構建與檢驗

制備生物細胞感受態，將按步驟(1)得到的編輯工具Vector-cas6-3-t/g-DNA通過轉化或轉染的方法導入生物細胞中，選擇培養得到潛在的基因編輯重組子；對潛在重組子進行功能鑒定、靶序列PCR擴增及測序分析，得到正確的基因編輯重組子。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的SviCas6和SviCas3指原始的或氨基酸序列突變后的SviCas6和SviCas3。

4.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的t-DNA指合成的按所需遺傳功能設計的具有與靶序列兩端互補的DNA片段，可與編輯工具分離而獨立存在。

5.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的g-DNA指合成的可轉錄得到crRNA/CRISPR-RNA的DNA片段(由轉錄啟動子/promoter、重復序列/repeat、間隔序列/spacer及轉錄終止子/terminator組成)。

6.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的相應生物細胞的堿基優化的DNA序列指根據SviCas6和SviCas3氨基酸序列而優化的適合在不同生物細胞中蛋白表達的堿基優化的cDNA序列。

7.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的基因編輯重組子指因基因組中的DNA被專一性的敲除、插入、無痕點突變及任意組合的編輯后而導致宿主細胞的表型、功能及生理發生變化的遺傳穩定的重組子。

8.根據權利要求1或2所述的一種基于SviCas6-SviCas3的基因編輯方法，其特征在于：所述的生物細胞指原核生物細胞和真核生物細胞的任何一種，如：大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、人胚腎細胞等。