[發(fā)明專利]閃光型均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/T的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910409947.0
• 申請(qǐng)日: 2019-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN110031635A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江學(xué)成;楊曉光
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州普魯米生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開了一種閃光型均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T的方法，以血清作為待測(cè)樣品；包括以下步驟：抗體Ⅰ偶聯(lián)發(fā)光底物，得抗體Ⅰ?A；抗體Ⅱ偶聯(lián)辣根過氧化物酶，抗體Ⅱ?HRP；設(shè)計(jì)兩種檢測(cè)體系，將檢測(cè)體系孵育后加入激發(fā)液，立即檢測(cè)發(fā)光信號(hào)；先將cTnI/cTnT樣品進(jìn)行梯度稀釋后作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得發(fā)光信號(hào)和心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T濃度所對(duì)應(yīng)的公式；然后將待測(cè)樣品作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，從而最終獲得待測(cè)樣品中心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T的濃度。采用該方法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T，具有快速、高靈敏度的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種閃光型均相化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T的方法。

背景技術(shù)

心肌肌鈣蛋白是一種蛋白絡(luò)合物，分布于心肌原肌球蛋白上的規(guī)則間隙，調(diào)控心臟肌肉收縮。由心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和心肌肌鈣蛋白C(cTnC)三種亞單位組成。其中，cTnT和cTnI有獨(dú)特的氨基酸序列，具有很好的心肌特異性。cTnT和cTnI在正常人體血清中含量極微，當(dāng)心肌細(xì)胞受損后游離的cTnT和cTnI從心肌細(xì)胞內(nèi)迅速釋放進(jìn)入血液，使血中濃度迅速升高。CTnT半衰期很短只有2小時(shí)，游離cTnI的半衰期為2小時(shí)到5天。在臨床使用中，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)是能預(yù)測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(ACS)短期、中期甚至長期結(jié)局的一種獨(dú)立的預(yù)后診斷標(biāo)志物。CTnT還常用于判斷急性心肌梗死大小，也可用于評(píng)估患者的溶栓療法成功與否。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是一個(gè)十分敏感和特異的急性心肌梗死標(biāo)志物，心肌損傷后4～6小時(shí)釋放入血，達(dá)到診斷決定值。對(duì)其連續(xù)測(cè)定可用于急性心肌梗死的診斷、動(dòng)態(tài)檢測(cè)及療效觀察。也可用于評(píng)估溶栓治療的效果，對(duì)不穩(wěn)定心絞痛預(yù)后判斷有極其重要的意義。

心肌肌鈣蛋白檢測(cè)方法最早都是使用放射免疫法(RIA)測(cè)定，操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長，且存在放射污染的危險(xiǎn)，因此逐步被更安全簡單的方法取代。自八十年代開始，由于各種非放免技術(shù)的發(fā)展和相應(yīng)自動(dòng)化儀器的誕生，逐漸代替了RIA方法。目前臨床應(yīng)用比較普遍的檢測(cè)cTnI的方法主要有膠體金免疫檢測(cè)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)等。膠體金試紙檢測(cè)法具有操作簡單快捷使用方便，不受時(shí)間地點(diǎn)限制，適合于床旁檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，然而只能夠定性的檢測(cè)樣本的結(jié)果，并受主觀因素影響，檢測(cè)靈敏度低常有假陰性發(fā)生。也有研究者開發(fā)一種輔助檢測(cè)設(shè)備讀取光信號(hào)值，達(dá)到相對(duì)定量避免主觀因素的效果。相對(duì)于膠體金免疫檢測(cè)法，酶聯(lián)免疫檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)更加準(zhǔn)確，誤差更小，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，并且靈敏度更高。但是檢測(cè)體系中需要載體，檢測(cè)過程中需要洗滌等步驟，操作繁瑣檢測(cè)用時(shí)長，也增加檢測(cè)的成本，并且儀器成本也相對(duì)較高。

目前現(xiàn)有的利用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的方法為：磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法。該方法是將生物素標(biāo)記的抗體、待測(cè)抗原與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體形成“三明治”結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。隨后加入連有鏈霉親和素的磁性微粒，通過鏈霉親和素與生物素的特異性結(jié)合使抗原抗體復(fù)合物連接在磁微粒上，在外加磁場(chǎng)中將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其他物質(zhì)分離。去上清后清洗磁微粒復(fù)合物，加入發(fā)光底物，通過發(fā)光儀檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)抗原含量呈正比，使用相應(yīng)的計(jì)算方法即可計(jì)算出樣本中待測(cè)抗原的濃度。該方法使用磁微粒作為固相支持物，檢測(cè)過程中需要外加磁場(chǎng)，并且需要洗滌步驟，因此存在操作繁瑣，檢測(cè)用時(shí)長的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、高靈敏度的閃光型均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種閃光型均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/心肌肌鈣蛋白T的方法，以血清作為待測(cè)樣品；包括以下步驟：

1)、抗體Ⅰ偶聯(lián)發(fā)光底物，得抗體Ⅰ-A；

2)、抗體Ⅱ偶聯(lián)辣根過氧化物酶，抗體Ⅱ-HRP；

3)、檢測(cè)：

分成以下兩種方式：