[發(fā)明專利]一種純化Fc融合蛋白的純化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910409793.5
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN110172102A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 游文龍;李文賓
• 申請（專利權(quán)）人: 北京軍科華仞生物工程技術(shù)研究有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京中企訊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11677
• 代理人: 熊亮

本發(fā)明公開了一種純化Fc融合蛋白的純化方法，其技術(shù)方案要點(diǎn)是其步驟為：(1)用Mabselect SuRe LX捕獲GLP?1?Fc融合蛋白；(2)用Capto Q ImpRes離子交換層析進(jìn)一步去除降解片段；(3)用CHT I型填料去除大量的聚集體。本發(fā)明能夠去除目的蛋白中的降解和聚集體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Fc融合蛋白，更具體的說，它涉及一種純化Fc融合蛋白的純化方法。

背景技術(shù)

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子與IgG的Fc片段融合產(chǎn)生的新型蛋白。功能性蛋白分子連接Fc片段后，提高了功能蛋白的穩(wěn)定性，并增加了體內(nèi)的半衰期。Fc片段可以融合一種或兩種不同的功能片段，形成高效的靶向藥物，該類蛋白不僅保留了功能蛋白的生物學(xué)活性，并且保留了Fc段介導(dǎo)的ADCC和CDC效應(yīng)的能力。2018年上半年全球藥物銷售額Top 15中，F(xiàn)c融合蛋白類藥物(Amgen/Pfizer的Enbrel和Bayer/Regeneron的Eylea)銷售占兩席，其中Enbrel的2018年上半年銷售額達(dá)34.64億美元。

Fc融合蛋白在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)上清中穩(wěn)定性較差，容易形成降解和多聚。常規(guī)的純化方法包括親和層析快速捕獲，陰陽離子交換層析或疏水層析精純進(jìn)一步去除產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如降解和多聚，以及除去工藝相關(guān)雜質(zhì)，如HCP、HCD及protein A脫落等。聚集體的去除主要應(yīng)用陽離子層析和疏水層析。研究發(fā)現(xiàn)聚集體的含量≥10％后，陽離子層析和疏水層析就很難達(dá)到理想的效果，而Bio-Rad公司的羥基磷灰石填料可以去除大量的聚集體。羥基磷灰石(CHT)，分子式：Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，是一種磷酸鈣化合物，包括鈣離子(C位點(diǎn))，羥基，磷酸根(P位點(diǎn))。CHT具有獨(dú)特的分離效果，良好的選擇性和分辨率，經(jīng)常用于分離其它介質(zhì)所不能分離的、性質(zhì)比較接近的蛋白。Bio-Rad公司的CHT分兩種類型，CHT I型和CHT II型，其中CHT I型的蛋白載量比較高，且對酸性蛋白具有更高的載量。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種去除目的蛋白中的降解和聚集體的純化Fc融合蛋白的純化方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種純化Fc融合蛋白的純化方法，其步驟為：

(1)用Mabselect SuRe LX捕獲6LP-1-Fc融合蛋白；

(2)用Capto Q ImpRes離子交換層析進(jìn)一步去除降解片段；

(3)用CHT I型填料去除大量的聚集體。

本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：根據(jù)步驟(1)，其具體操作步驟為：

(1.1)用親和平衡液平衡層析柱4個(gè)柱體積；

(1.2)上樣，上樣保留時(shí)間為4-10min；

(1.3)完成上樣后，用親和平衡液再平衡3個(gè)柱體積，然后用淋洗液沖洗4個(gè)柱體積；

(1.4)再用醋酸鹽沖洗層析柱3個(gè)柱體積，樣品用醋酸鹽洗脫，收集主峰；

(1.5)用NaOH清洗3個(gè)柱體積，用平衡液平衡至pH穩(wěn)定后，2個(gè)柱體積的乙醇保存層析柱。

本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：步驟(1.1)中，親和平衡液為25mM Tris，25mM NaCl，pH7.5；

步驟(1.3)中，淋洗液為25mM Tris，0.3M NaCl，pH7.5；

步驟(1.4)中，沖洗的醋酸鹽為50mM醋酸鹽-pH4.5，洗脫的醋酸鹽為50mM醋酸鹽-pH＝3.5；

步驟(1.5)中，NaOH為0.1M NaOH，乙醇為20％乙醇。