[發明專利]諾卡氏菌感受態細胞的制備方法與諾卡氏菌基因編輯方法

有效

• 申請號: 201910409358.2
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN110129228B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 夏立群;王文基;魯義善;侯素瑩;譚萬春;陳建林
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學深圳研究院;廣東海洋大學;深圳義海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/365
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 肖麗

本發明提供一種諾卡氏菌感受態細胞的制備方法與諾卡氏菌基因編輯方法。本發明的諾卡氏菌感受態細胞的制備方法采用溶菌酶對諾卡氏菌進行處理，從而降低了諾卡氏菌細胞壁的厚度，最終制備出容易接受外源DNA的諾卡氏菌感受態細胞，該方法操作簡便快捷，具有較高的應用價值。本發明的諾卡氏菌基因編輯方法首次將CRISPR/Cas9系統運用到諾卡氏菌中，構建了CRISPR/Cas9基因編輯質粒并將其轉化進入諾卡氏菌對目的基因進行編輯，該方法操作簡便快捷，具有較高的應用價值，為研究諾卡氏菌基因功能、構建諾卡氏菌基因缺失株以及制備諾卡氏菌基因缺失株疫苗奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種諾卡氏菌感受態細胞的制備方法與諾卡氏菌基因編輯方法。

背景技術

鰤魚諾卡氏菌是水產養殖諾卡氏菌病的主要致病菌，當魚類免疫力低下時，可通過餌料、鰓或傷口感染。鰤魚諾卡氏菌在分類學上屬放線菌目、諾卡氏菌科、諾卡氏菌屬，為革蘭氏陽性菌。鰤魚諾卡氏菌是一種兼性胞內寄生菌，在其感染過程中，菌體會被魚體吞噬細胞，主要是巨噬細胞吞噬。鰤魚諾卡氏菌能在巨噬細胞內存活，并可隨著巨噬細胞的遷移而擴散感染到魚體的各個器官。該菌主要能引起魚體內臟產生白色的結節，導致魚類運動遲緩，食欲下降，免疫力低下，進而導致死亡。鰤魚諾卡氏菌可感染烏鱧、卵形鯧鲹、大黃魚等20多種海、淡水魚類，導致魚類慢性死亡，或由于引發體表潰瘍而降低成魚商品價值，給水產養殖業帶來巨大的損失，加之發病率逐年增加，對魚類養殖業危害越來越嚴重，因此亟需通過分子生物學手段研究諾卡氏菌基因的功能并深入了解鰤魚諾卡氏菌的致病機理。

諾卡氏菌的細胞壁主要由肽聚糖、脂磷壁酸和細胞壁蛋白質等組成，細胞壁較厚，目前制備感受態細胞的常用方法主要有氯化鈣法、甘油-聚乙二醇法、氯化銣法等，但是這些方法對于諾卡氏菌基本不起作用，也即是說，采用這些方法根本無法制備能夠有效吸收外源DNA的諾卡氏菌感受態細胞。

CRISPR(Clustered?Regulatory?Interspaced?Short?Palindromic?Respeats，CRISPR)是廣泛存在于細菌和古細菌中的一種生物防御系統，是細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。CRISPR系統分為I型系統、II型系統和III型系統，CRISPR系統需要CRISPR相關蛋白(Cas蛋白)共同發揮作用，其中經過改造的II型系統CRISPR/Cas9成為現在廣泛使用的基因改造工具，CRISPR/Cas9由單一引導RNA(single?guide?RNA，sgRNA)介導，sgRNA包括兩部分，一部分是sgRNA錨定序列，sgRNA錨定序列可以根據不同的目的基因以及位點設計，另一部分是固有序列，固有序列通常為設計在質粒上的sgRNA-tracr序列，Cas9蛋白識別基因組上PAM(protospacer?adjacent?motif，PAM)及其上游20bp序列，并在PAM上游的sgRNA錨定序列位置產生雙鏈切口，從而達到基因編輯的目的，研究基因功能。然而，目前尚未有相關研究將CRISPR/Cas9技術應用到諾卡氏菌中。

發明內容

本發明的目的首先在于提供一種諾卡氏菌感受態細胞的制備方法，能夠制備出容易接受外源DNA的諾卡氏菌感受態細胞，該方法操作簡便快捷，具有較高的應用價值。

本發明的目的還在于提供一種諾卡氏菌基因編輯方法，該方法操作簡便快捷，具有較高的應用價值，同時為研究諾卡氏菌基因功能、構建諾卡氏菌基因缺失株以及制備諾卡氏菌基因缺失株疫苗奠定基礎。

為實現以上目的，本發明首先提供一種諾卡氏菌感受態細胞的制備方法，包括：

取處于對數生長期的諾卡氏菌菌液于離心管中，第一次離心收集諾卡氏菌的菌體，采用無菌水或無菌水溶液洗滌所述菌體后，再采用無菌水或無菌水溶液第一次重懸所述菌體，然后在重懸的菌體中加入溶菌酶進行處理，處理后第二次離心收集諾卡氏菌的菌體，采用無菌水或無菌水溶液對所述菌體進行第二次重懸，得到諾卡氏菌感受態細胞。