[發明專利]諾卡氏菌感受態細胞的制備方法與諾卡氏菌基因編輯方法

有效

• 申請號: 201910409358.2
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN110129228B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 夏立群;王文基;魯義善;侯素瑩;譚萬春;陳建林
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學深圳研究院;廣東海洋大學;深圳義海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/365
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 肖麗

1.一種諾卡氏菌基因編輯方法，其特征在于，包括：

步驟a.確定諾卡氏菌中需要被編輯的目的基因，獲取所述目的基因的sgRNA錨定序列，提供Cas9載體，在所述Cas9載體中插入所述sgRNA錨定序列，獲得CRISPR/Cas9基因編輯質粒；其中，借助CRISPR在線設計工具設計得到所述目的基因的sgRNA錨定序列；將寡聚核苷酸片段插入Cas9載體，獲得CRISPR/Cas9基因編輯質粒；

步驟b.制備諾卡氏菌感受態細胞；所述制備方法包括：

取處于對數生長期的諾卡氏菌菌液于離心管中，第一次離心收集諾卡氏菌的菌體，采用無菌水或無菌水溶液洗滌所述菌體后，再采用無菌水或無菌水溶液第一次重懸所述菌體，然后在重懸的菌體中加入溶菌酶進行處理，處理后第二次離心收集諾卡氏菌的菌體，采用無菌水或無菌水溶液對所述菌體進行第二次重懸，得到諾卡氏菌感受態細胞；

所述無菌水溶液為甘油水溶液，所述甘油水溶液中甘油的質量百分比為5％-20％；

所述處于對數生長期的諾卡氏菌菌液的培養方法為：將諾卡氏菌接種至固體培養基表面，待長出單菌落后，挑取單菌落至液體培養基中，培養至對數生長期；其中，將諾卡氏菌接種至固體培養基表面的方法為劃線接種法；

在重懸的菌體中加入溶菌酶后中，溶菌酶的最終質量濃度為100μg/ml-300mg/ml；

在重懸的菌體中加入溶菌酶后處理的時間為0.3-5小時，期間每隔10-30分鐘搖動盛裝所述菌體的容器；

對所述菌體進行第二次重懸后，將制得的諾卡氏菌感受態細胞分裝到1.5ml離心管中，每管裝500微升；

所述第一次離心與所述第二次離心的溫度均為2℃-6℃；

步驟c.將所述CRISPR/Cas9基因編輯質粒轉化進入所述諾卡氏菌感受態細胞中，對轉化后的所述諾卡氏菌感受態細胞進行復蘇培養，將復蘇培養后的菌液涂布到含有抗生素的固體培養基表面進行培養，篩選陽性克隆子。

2.如權利要求1所述的諾卡氏菌基因編輯方法，其特征在于，所述轉化的方法為電轉化。

3.如權利要求2所述的諾卡氏菌基因編輯方法，其特征在于，所述電轉化的參數為：電壓150-300V，脈沖間隔時間600-1500ms，脈沖持續時間60-150μs，方波20-40個。

4.如權利要求1所述的諾卡氏菌基因編輯方法，其特征在于，所述步驟a還包括：在所述Cas9載體中插入從所述目的基因的sgRNA錨定序列和相應PAM位點的上下游分別擴增的同源臂片段。

5.如權利要求1所述的諾卡氏菌基因編輯方法，其特征在于，所述Cas9載體為pCRISPomyces-2質粒。

6.如權利要求1-5任一項所述的諾卡氏菌基因編輯方法在研究諾卡氏菌基因功能、構建諾卡氏菌基因缺失株以及制備諾卡氏菌基因缺失株疫苗中的應用。