[發明專利]一種體外穩定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法在審
| 申請號: | 201910408509.2 | 申請日: | 2019-05-16 |
| 公開(公告)號: | CN110511907A | 公開(公告)日: | 2019-11-29 |
| 發明(設計)人: | 鄧蒙蒙;程簫;劉丹;吳疆;王保如 | 申請(專利權)人: | 安徽瑞達健康產業有限公司 |
| 主分類號: | C12N5/0783 | 分類號: | C12N5/0783 |
| 代理公司: | 34158 合肥方舟知識產權代理事務所(普通合伙) | 代理人: | 劉躍<國際申請>=<國際公布>=<進入國 |
| 地址: | 230000 安徽省合肥市高新區*** | 國省代碼: | 安徽;34 |
| 權利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 單個核細胞 細胞毒活性 換液 增高 外周血單個核細胞 無血清細胞培養基 體外培養條件 臨床應用 免疫分選 體外培養 同種異體 細胞活性 細胞因子 高純度 擴增 體外 種體 自體 去除 收獲 | ||
本發明公開了一種體外穩定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法,具體涉及自體或同種異體外周血單個核細胞在體外穩定的、大量擴增高純度、高細胞毒活性的NK細胞的方法,步驟為:(1)分離單個核細胞;(2)通過免疫分選去除單個核細胞中的CD3+T淋巴細胞;(3)加入NK細胞培養用無血清細胞培養基及細胞因子IL?15、IL?12、IL?21、IL?2和OK432,體外培養2?5天后全換液;(4)NK細胞換液;(5)收獲NK細胞。在體外培養條件下穩定擴增大量高純度、高細胞活性的NK細胞,同時減少T細胞數量,且滿足臨床應用所需。
技術領域:
本發明涉及到免疫細胞治療領域,具體是一種自體或同種異體外周血單個核細胞在體 外穩定的、大量擴增高純度、高細胞毒活性的NK細胞的方法。
背景技術:
細胞免疫治療是目前最具有前景的腫瘤治療方式之一,通過體外擴增或改造后回輸到 病人體內達到殺傷腫瘤細胞的目的或者通過活化機體免疫系統,增強腫瘤患者自身免疫功 能從而抵抗腫瘤。目前,NK細胞免疫治療受到越來越多的重視。NK細胞占人外周血淋巴 細胞的5-15%,一般定義其表型為CD3-CD56+,NK細胞又可以進一步細分為兩個主要的亞群:具有免疫調節功能的CD56highCD16-細胞和具有細胞毒活性的CD56dimCD16+細胞。 NK細胞在抗病毒感染和抗腫瘤的早期免疫反應中發揮著重要的免疫監視功能,NK細胞不 需要識別腫瘤特異性抗原,便可直接、快速的發揮細胞毒活性。特別重要的是NK細胞能 夠有效地清除機體內的腫瘤干細胞樣細胞,抑制腫瘤的生長和轉移。最新的研究表明,阻 斷NK細胞表面的免疫檢測點受體TIGIT,可以有效的阻止NK細胞的耗竭,促進NK細 胞依賴的腫瘤免疫,抑制多種小鼠惡性腫瘤的生長。阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以激活 NK細胞和T細胞、逆轉腫瘤免疫微環境,增強機體內源性抗腫瘤免疫效應。因此,NK 細胞在機體免疫系統抵抗腫瘤的反應中發揮必不可少的作用,機體NK細胞功能紊亂,是 腫瘤發生、發展的可能原因之一。自體或者同種異體NK細胞已經用于治療惡性淋巴瘤、 難治性非霍奇金淋巴瘤、復發性/難治性急性白血病、急性髓性白血病、兒童復發/難治性 神經母細胞瘤、晚期胃癌、結直腸癌、結直腸癌/胰腺癌肝轉移以及多種復發性、轉移性實 體瘤。臨床顯示出良好的耐受性和一定的治療效果。NK細胞的治療效果和回輸的NK細 胞的純度和數量呈正相關。
目前已經有一些可提供臨床使用的NK細胞擴增技術,但是多采用飼養細胞(例如,表 達IL-15和41BB配體的K562細胞、EBV轉化的類淋巴母細胞細胞系、Wilm’s腫瘤細胞、 射線輻照的PBMCs等)進行刺激外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)或者純化富集后的NK細胞獲得大量功能完備的NK細胞。現有的NK細胞擴增方 法要么NK細胞的擴增數量較低,難以滿足臨床應用需求;要么采用飼養細胞的培養方法, 臨床應用存在一定的風險,而且NK細胞擴增培養步驟繁瑣,成本較高,NK細胞比例相 對較低,有殘留的T細胞和B細胞,具有引起GVHD的風險。目前一些專利文獻報道的 無飼養細胞的NK細胞擴增方法,多采用anti-CD3抗體和anti-CD16抗體包被細胞培養瓶 刺激、活化NK細胞,細胞培養方法繁瑣、不穩定、擴增的NK細胞純度較低。
而且在現有的技術研究中,試驗又發現,供者在提供NK細胞時,并不能達到完全的純化目的,有一定量的T細胞跟著NK細胞一起輸入到了受者的體內。而這些跟著NK 細胞一起輸注的T細胞由于膜上的相關配體的影響,將對NK細胞的KIR的表達產生 一定的干擾作用。針對以上情況,現有的處理方法是將這些準備輸入到患者體內的NK細 胞和混雜于其中的T細胞,提前進行照射、清除、凈化等的處理,使得T細胞的數量減 少到最低。以上方法雖然較好地處理了混雜于NK細胞中的T細胞,卻并不是毫無問題 的。因為,在進行照射等處理的同時,NK細胞必然也會遭受到各種理化因素的影響,繼 而會產生如下的后果:數量減少、活性降低、還有一些使NK細胞產生未知的、不利的變 化。
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息,商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于安徽瑞達健康產業有限公司,未經安徽瑞達健康產業有限公司許可,擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作,請聯系【客服】
本文鏈接:http://www.szxzyx.cn/pat/books/201910408509.2/2.html,轉載請聲明來源鉆瓜專利網。





