[發(fā)明專(zhuān)利]一種體外穩(wěn)定擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性NK細(xì)胞的方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910408509.2 | 申請(qǐng)日: | 2019-05-16 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN110511907A | 公開(kāi)(公告)日: | 2019-11-29 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 鄧蒙蒙;程簫;劉丹;吳疆;王保如 | 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人: | 安徽瑞達(dá)健康產(chǎn)業(yè)有限公司 |
| 主分類(lèi)號(hào): | C12N5/0783 | 分類(lèi)號(hào): | C12N5/0783 |
| 代理公司: | 34158 合肥方舟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) | 代理人: | 劉躍<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó) |
| 地址: | 230000 安徽省合肥市高新區(qū)*** | 國(guó)省代碼: | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書(shū): | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū): | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 單個(gè)核細(xì)胞 細(xì)胞毒活性 換液 增高 外周血單個(gè)核細(xì)胞 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基 體外培養(yǎng)條件 臨床應(yīng)用 免疫分選 體外培養(yǎng) 同種異體 細(xì)胞活性 細(xì)胞因子 高純度 擴(kuò)增 體外 種體 自體 去除 收獲 | ||
本發(fā)明公開(kāi)了一種體外穩(wěn)定擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性NK細(xì)胞的方法,具體涉及自體或同種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外穩(wěn)定的、大量擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性的NK細(xì)胞的方法,步驟為:(1)分離單個(gè)核細(xì)胞;(2)通過(guò)免疫分選去除單個(gè)核細(xì)胞中的CD3+T淋巴細(xì)胞;(3)加入NK細(xì)胞培養(yǎng)用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞因子IL?15、IL?12、IL?21、IL?2和OK432,體外培養(yǎng)2?5天后全換液;(4)NK細(xì)胞換液;(5)收獲NK細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下穩(wěn)定擴(kuò)增大量高純度、高細(xì)胞活性的NK細(xì)胞,同時(shí)減少T細(xì)胞數(shù)量,且滿(mǎn)足臨床應(yīng)用所需。
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及到免疫細(xì)胞治療領(lǐng)域,具體是一種自體或同種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體 外穩(wěn)定的、大量擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性的NK細(xì)胞的方法。
背景技術(shù):
細(xì)胞免疫治療是目前最具有前景的腫瘤治療方式之一,通過(guò)體外擴(kuò)增或改造后回輸?shù)?病人體內(nèi)達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的或者通過(guò)活化機(jī)體免疫系統(tǒng),增強(qiáng)腫瘤患者自身免疫功 能從而抵抗腫瘤。目前,NK細(xì)胞免疫治療受到越來(lái)越多的重視。NK細(xì)胞占人外周血淋巴 細(xì)胞的5-15%,一般定義其表型為CD3-CD56+,NK細(xì)胞又可以進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)主要的亞群:具有免疫調(diào)節(jié)功能的CD56highCD16-細(xì)胞和具有細(xì)胞毒活性的CD56dimCD16+細(xì)胞。 NK細(xì)胞在抗病毒感染和抗腫瘤的早期免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視功能,NK細(xì)胞不 需要識(shí)別腫瘤特異性抗原,便可直接、快速的發(fā)揮細(xì)胞毒活性。特別重要的是NK細(xì)胞能 夠有效地清除機(jī)體內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。最新的研究表明,阻 斷NK細(xì)胞表面的免疫檢測(cè)點(diǎn)受體TIGIT,可以有效的阻止NK細(xì)胞的耗竭,促進(jìn)NK細(xì) 胞依賴(lài)的腫瘤免疫,抑制多種小鼠惡性腫瘤的生長(zhǎng)。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以激活 NK細(xì)胞和T細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境,增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)。因此,NK 細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的反應(yīng)中發(fā)揮必不可少的作用,機(jī)體NK細(xì)胞功能紊亂,是 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的可能原因之一。自體或者同種異體NK細(xì)胞已經(jīng)用于治療惡性淋巴瘤、 難治性非霍奇金淋巴瘤、復(fù)發(fā)性/難治性急性白血病、急性髓性白血病、兒童復(fù)發(fā)/難治性 神經(jīng)母細(xì)胞瘤、晚期胃癌、結(jié)直腸癌、結(jié)直腸癌/胰腺癌肝轉(zhuǎn)移以及多種復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性實(shí) 體瘤。臨床顯示出良好的耐受性和一定的治療效果。NK細(xì)胞的治療效果和回輸?shù)腘K細(xì) 胞的純度和數(shù)量呈正相關(guān)。
目前已經(jīng)有一些可提供臨床使用的NK細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù),但是多采用飼養(yǎng)細(xì)胞(例如,表 達(dá)IL-15和41BB配體的K562細(xì)胞、EBV轉(zhuǎn)化的類(lèi)淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系、Wilm’s腫瘤細(xì)胞、 射線(xiàn)輻照的PBMCs等)進(jìn)行刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)或者純化富集后的NK細(xì)胞獲得大量功能完備的NK細(xì)胞。現(xiàn)有的NK細(xì)胞擴(kuò)增方 法要么NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量較低,難以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求;要么采用飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法, 臨床應(yīng)用存在一定的風(fēng)險(xiǎn),而且NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)步驟繁瑣,成本較高,NK細(xì)胞比例相 對(duì)較低,有殘留的T細(xì)胞和B細(xì)胞,具有引起GVHD的風(fēng)險(xiǎn)。目前一些專(zhuān)利文獻(xiàn)報(bào)道的 無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法,多采用anti-CD3抗體和anti-CD16抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶 刺激、活化NK細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)方法繁瑣、不穩(wěn)定、擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度較低。
而且在現(xiàn)有的技術(shù)研究中,試驗(yàn)又發(fā)現(xiàn),供者在提供NK細(xì)胞時(shí),并不能達(dá)到完全的純化目的,有一定量的T細(xì)胞跟著NK細(xì)胞一起輸入到了受者的體內(nèi)。而這些跟著NK 細(xì)胞一起輸注的T細(xì)胞由于膜上的相關(guān)配體的影響,將對(duì)NK細(xì)胞的KIR的表達(dá)產(chǎn)生 一定的干擾作用。針對(duì)以上情況,現(xiàn)有的處理方法是將這些準(zhǔn)備輸入到患者體內(nèi)的NK細(xì) 胞和混雜于其中的T細(xì)胞,提前進(jìn)行照射、清除、凈化等的處理,使得T細(xì)胞的數(shù)量減 少到最低。以上方法雖然較好地處理了混雜于NK細(xì)胞中的T細(xì)胞,卻并不是毫無(wú)問(wèn)題 的。因?yàn)椋谶M(jìn)行照射等處理的同時(shí),NK細(xì)胞必然也會(huì)遭受到各種理化因素的影響,繼 而會(huì)產(chǎn)生如下的后果:數(shù)量減少、活性降低、還有一些使NK細(xì)胞產(chǎn)生未知的、不利的變 化。
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- 同類(lèi)專(zhuān)利
- 專(zhuān)利分類(lèi)
C12N 微生物或酶;其組合物
C12N5-00 未分化的人類(lèi)、動(dòng)物或植物細(xì)胞,如細(xì)胞系;組織;它們的培養(yǎng)或維持;其培養(yǎng)基
C12N5-02 .單細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的增殖;它的維持;其培養(yǎng)基
C12N5-04 .植物細(xì)胞或組織
C12N5-07 .動(dòng)物細(xì)胞或組織
C12N5-09 .腫瘤細(xì)胞
C12N5-10 .經(jīng)引入外來(lái)遺傳物質(zhì)而修飾的細(xì)胞,如病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞
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