[發(fā)明專(zhuān)利]一種體外穩(wěn)定擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性NK細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910408509.2
• 申請(qǐng)日: 2019-05-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110511907A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧蒙蒙;程簫;劉丹;吳疆;王保如
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽瑞達(dá)健康產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0783
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 34158 合肥方舟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 劉躍<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó)

本發(fā)明公開(kāi)了一種體外穩(wěn)定擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性NK細(xì)胞的方法，具體涉及自體或同種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外穩(wěn)定的、大量擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性的NK細(xì)胞的方法，步驟為：(1)分離單個(gè)核細(xì)胞；(2)通過(guò)免疫分選去除單個(gè)核細(xì)胞中的CD3⁺T淋巴細(xì)胞；(3)加入NK細(xì)胞培養(yǎng)用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞因子IL?15、IL?12、IL?21、IL?2和OK432，體外培養(yǎng)2?5天后全換液；(4)NK細(xì)胞換液；(5)收獲NK細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下穩(wěn)定擴(kuò)增大量高純度、高細(xì)胞活性的NK細(xì)胞，同時(shí)減少T細(xì)胞數(shù)量，且滿(mǎn)足臨床應(yīng)用所需。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及到免疫細(xì)胞治療領(lǐng)域，具體是一種自體或同種異體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體 外穩(wěn)定的、大量擴(kuò)增高純度、高細(xì)胞毒活性的NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞免疫治療是目前最具有前景的腫瘤治療方式之一，通過(guò)體外擴(kuò)增或改造后回輸?shù)?病人體內(nèi)達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的或者通過(guò)活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤患者自身免疫功 能從而抵抗腫瘤。目前，NK細(xì)胞免疫治療受到越來(lái)越多的重視。NK細(xì)胞占人外周血淋巴 細(xì)胞的5-15％，一般定義其表型為CD3^-CD56⁺，NK細(xì)胞又可以進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)主要的亞群：具有免疫調(diào)節(jié)功能的CD56^highCD16^-細(xì)胞和具有細(xì)胞毒活性的CD56^dimCD16⁺細(xì)胞。 NK細(xì)胞在抗病毒感染和抗腫瘤的早期免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視功能，NK細(xì)胞不 需要識(shí)別腫瘤特異性抗原，便可直接、快速的發(fā)揮細(xì)胞毒活性。特別重要的是NK細(xì)胞能 夠有效地清除機(jī)體內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。最新的研究表明，阻 斷NK細(xì)胞表面的免疫檢測(cè)點(diǎn)受體TIGIT，可以有效的阻止NK細(xì)胞的耗竭，促進(jìn)NK細(xì) 胞依賴(lài)的腫瘤免疫，抑制多種小鼠惡性腫瘤的生長(zhǎng)。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以激活 NK細(xì)胞和T細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)。因此，NK 細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的反應(yīng)中發(fā)揮必不可少的作用，機(jī)體NK細(xì)胞功能紊亂，是 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的可能原因之一。自體或者同種異體NK細(xì)胞已經(jīng)用于治療惡性淋巴瘤、 難治性非霍奇金淋巴瘤、復(fù)發(fā)性/難治性急性白血病、急性髓性白血病、兒童復(fù)發(fā)/難治性 神經(jīng)母細(xì)胞瘤、晚期胃癌、結(jié)直腸癌、結(jié)直腸癌/胰腺癌肝轉(zhuǎn)移以及多種復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性實(shí) 體瘤。臨床顯示出良好的耐受性和一定的治療效果。NK細(xì)胞的治療效果和回輸?shù)腘K細(xì) 胞的純度和數(shù)量呈正相關(guān)。

目前已經(jīng)有一些可提供臨床使用的NK細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，但是多采用飼養(yǎng)細(xì)胞(例如，表 達(dá)IL-15和41BB配體的K562細(xì)胞、EBV轉(zhuǎn)化的類(lèi)淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系、Wilm’s腫瘤細(xì)胞、 射線(xiàn)輻照的PBMCs等)進(jìn)行刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或者純化富集后的NK細(xì)胞獲得大量功能完備的NK細(xì)胞。現(xiàn)有的NK細(xì)胞擴(kuò)增方 法要么NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量較低，難以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求；要么采用飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法， 臨床應(yīng)用存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，而且NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)步驟繁瑣，成本較高，NK細(xì)胞比例相 對(duì)較低，有殘留的T細(xì)胞和B細(xì)胞，具有引起GVHD的風(fēng)險(xiǎn)。目前一些專(zhuān)利文獻(xiàn)報(bào)道的 無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，多采用anti-CD3抗體和anti-CD16抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶 刺激、活化NK細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)方法繁瑣、不穩(wěn)定、擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度較低。

而且在現(xiàn)有的技術(shù)研究中，試驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)，供者在提供NK細(xì)胞時(shí)，并不能達(dá)到完全的純化目的，有一定量的T細(xì)胞跟著NK細(xì)胞一起輸入到了受者的體內(nèi)。而這些跟著NK 細(xì)胞一起輸注的T細(xì)胞由于膜上的相關(guān)配體的影響，將對(duì)NK細(xì)胞的KIR的表達(dá)產(chǎn)生 一定的干擾作用。針對(duì)以上情況，現(xiàn)有的處理方法是將這些準(zhǔn)備輸入到患者體內(nèi)的NK細(xì) 胞和混雜于其中的T細(xì)胞，提前進(jìn)行照射、清除、凈化等的處理，使得T細(xì)胞的數(shù)量減 少到最低。以上方法雖然較好地處理了混雜于NK細(xì)胞中的T細(xì)胞，卻并不是毫無(wú)問(wèn)題 的。因?yàn)椋谶M(jìn)行照射等處理的同時(shí)，NK細(xì)胞必然也會(huì)遭受到各種理化因素的影響，繼 而會(huì)產(chǎn)生如下的后果：數(shù)量減少、活性降低、還有一些使NK細(xì)胞產(chǎn)生未知的、不利的變 化。