[發(fā)明專利]一種體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910408509.2 | 申請日： | 2019-05-16 |
| 公開（公告）號： | CN110511907A | 公開（公告）日： | 2019-11-29 |
| 發(fā)明（設計）人： | 鄧蒙蒙;程簫;劉丹;吳疆;王保如 | 申請（專利權）人： | 安徽瑞達健康產(chǎn)業(yè)有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0783 | 分類號： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 34158 合肥方舟知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) | 代理人： | 劉躍<國際申請>=<國際公布>=<進入國 |
| 地址： | 230000 安徽省合肥市高新區(qū)*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 單個核細胞 細胞毒活性 換液 增高 外周血單個核細胞 無血清細胞培養(yǎng)基 體外培養(yǎng)條件 臨床應用 免疫分選 體外培養(yǎng) 同種異體 細胞活性 細胞因子 高純度 擴增 體外 種體 自體 去除 收獲 | ||
1.一種體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，包括以下步驟：
(1)分離單個核細胞；
(2)免疫去除CD3+T淋巴細胞，去除CD3+T淋巴細胞后的單個核細胞的接種濃度為0.1-2×106cells/ml；
(3)加入無血清培養(yǎng)基、擴增因子；
(4)培養(yǎng)第2-5天全換液；
(5)NK細胞收獲；
其特征在于：步驟3中加入的擴增因子為：IL-15、IL-12、IL-21、IL-2和OK432。
2.根據(jù)權利要求1所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于：步驟3中加入的擴增因子終濃度為10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、500-2000U/ml IL-2和0.1-20μg/ml OK432。
3.根據(jù)權利要求1所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于：免疫去除CD3+T淋巴細胞的方法為免疫磁珠分選、膜泡分選和流式細胞儀分選等；去除CD3+T淋巴細胞后的單個核細胞的接種濃度為0.1-2×106cells/ml。
4.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于所述IL-15濃度為120-350ng/ml，IL-12濃度為100-300ng/ml。
5.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于所述IL-21濃度為100-380ng/ml。
6.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于所述IL-2濃度為1000-1800U/ml。
7.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于所述OK432濃度為0.5-8μg/ml。
8.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于所述單個核細胞來源于外周血、臍帶血、骨髓或誘導性多能干細胞。
9.根據(jù)權利要求2所述體外穩(wěn)定擴增高純度、高細胞毒活性NK細胞的方法，其特征在于：優(yōu)選第4天全換液培養(yǎng)，細胞濃度優(yōu)選為1×106cells/ml；第4天后根據(jù)細胞生長狀態(tài)補加含擴增所需細胞因子的無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106cells/ml。
10.一種體外擴增NK細胞的應用，其特征在于：采用權利要求1-9任一所述方法制備NK細胞用于腫瘤細胞免疫治療。
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