[發(fā)明專利]一種動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910407978.2
• 申請(qǐng)日: 2019-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN110058018A
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李青梅;張改平;王彥紅;郭軍慶;劉肖;石建州;李鴿;孫亞寧;楊繼飛;柴書軍;趙東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/531;C07K16/10;C07K14/11;C07K1/22;C12N15/70
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，由支撐板、抗原墊、金標(biāo)墊、檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，其特征在于，抗原墊上吸附流感病毒檢測(cè)抗原，金標(biāo)墊吸附膠體金標(biāo)記的抗流感病毒單克隆抗體mAb1，檢測(cè)膜上含有檢測(cè)線T“|”和質(zhì)控線C“|”印跡，檢測(cè)線T為抗流感病毒單克隆抗體mAb2或抗流感病毒多克隆抗體pAb1印跡，質(zhì)控線C為抗小鼠IgG兔抗體pAb2或金黃色葡萄球菌SPA印跡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，其特征在于，所述試紙以單克隆抗體阻斷模式檢測(cè)動(dòng)物流感中和抗體，若在檢測(cè)膜顯現(xiàn)兩條紅色條帶“||”，且檢測(cè)線T顯色強(qiáng)度與空白對(duì)照相當(dāng)，則為動(dòng)物流感抗體陰性；若顯現(xiàn)兩條紅色條帶“||”，但檢測(cè)線T明顯弱于空白對(duì)照，則為動(dòng)物流感抗體弱陽性；若只顯現(xiàn)一條紅色條帶“|”，則為動(dòng)物流感抗體強(qiáng)陽性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，其特征在于，抗流感病毒單克隆抗體mAb1具有血凝抑制HI和病毒中和VN活性，特異識(shí)別HA蛋白中和抗原表位；單克隆抗體mAb2具有血凝抑制HI活性，特異識(shí)別HA蛋白非中和抗原表位；抗原墊吸附流感病毒檢測(cè)抗原，流感病毒檢測(cè)抗原為流感病毒抗原、重組抗原或多肽抗原。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，其特征在于，所述抗流感病毒單克隆抗體mAb1和mAb2的制備方法為：

(1)流感病毒免疫抗原的制備

以不同亞型流感病毒經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，36～48h收取尿囊液，差速離心純化病毒抗原，4℃3000r/min低速離心30min去除雜質(zhì)，4℃60000r/min超速離心1h，用7mL0.01mol/L PBS(pH值7.2)重懸沉淀，以血凝試驗(yàn)測(cè)定流感病毒的HA效價(jià)達(dá)2^-12以上；

(2)抗流感病毒單克隆抗體的制備

(2.1)雜交瘤細(xì)胞株的建立

將流感病毒滅活病毒或疫苗為免疫抗原，免疫小鼠，建立抗不同亞型流感病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；

(2.2)單克隆抗體的制備

(2.3)單克隆抗體的鑒定

(2.3.1)病毒反應(yīng)譜

以免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體陽性克隆與不同亞型流感病毒的反應(yīng)性，篩選獲得識(shí)別廣譜流感病毒單克隆抗體；

(2.3.2)識(shí)別病毒蛋白

以Western blot檢測(cè)單克隆抗體識(shí)別流感病毒病毒蛋白；

(2.3.3)血凝抑制HI活性

以免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體腹水的單抗效價(jià)，以血凝抑制試驗(yàn)HI測(cè)定單克隆抗體腹水的HI活性，篩選獲得具有血凝抑制活性單克隆抗體，作為單克隆抗體mAb2，用于檢測(cè)線T印跡；

(2.3.4)病毒中和VN活性

以病毒中和試驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體腹水對(duì)不同亞型流感毒株的中和活性，篩選獲得具有病毒中和活性單克隆抗體，作為單克隆抗體mAb1，用于膠體金標(biāo)記；

(2.3.5)單克隆抗體亞型鑒定

利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測(cè)定流感病毒單克隆抗體的免疫球蛋白亞型；

(2.3.6)抗原表位分析

利用重疊合成多肽對(duì)單克隆抗體識(shí)別的抗原表位進(jìn)行分析；

(2.4)單克隆抗體的純化

以辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化單抗IgG。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，其特征在于，流感病毒抗原為經(jīng)甲醛或β-丙內(nèi)酯BPL滅活的流感病毒尿囊液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的動(dòng)物流感抗體阻斷檢測(cè)試紙，其特征在于，流感病毒抗原的具體制備方法為：以不同亞型流感病毒經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，36～120h收取雞胚尿囊液，4℃3000r/min低速離心30min，取上清，以血凝試驗(yàn)測(cè)定流感病毒的HA效價(jià)達(dá)2^-12以上；分別在流感病毒尿囊液中加入終濃度為0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙內(nèi)酯，充分混勻，分別置于4℃滅活48h或37℃滅活9h，制備流感病毒滅活病毒抗原。