[發明專利]一種用于抗器官移植排斥反應的脂質體及制備方法與應用

有效

• 申請號: 201910406036.2
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN110124056B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 郭猛;劉艷芳;劉芳;張璐定;王全興;丁國善;曹雪濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: A61K47/69
• 分類號: A61K47/69;A61K47/66;A61K47/64;A61K45/00;A61P37/06
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

1.一種用于抗器官移植排斥反應的脂質體，其特征在于，是由以下原料制備而成：

鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體負載在人工脂質體中，鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體負載在人工脂質體中濃度為0.1～1ng/μL，

生物素化的Qa-1或HLA-E與生物素化PD-L1均為等摩爾比，

生物素化的Qa-1、生物素化PD-L1的總量與上述鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體負載人工脂質體的摩爾比為100:1～200:1；

或，生物素化的HLA-E、生物素化PD-L1的總量與上述鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體負載人工脂質體的摩爾比為100:1～200:1；

所述人工脂質體是由以下原料制備：磷脂酰膽堿10mg～100mg、膽固醇1mg～10mg、0.1～1mg神經節苷脂GM2，pH＝6.5的PBS；人工脂質體濃度為10⁵～10⁶個/mL；

所述鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體的氨基酸序列如Seq No.1所示；

所述Qa-1、PD-L1與HLA-E的氨基酸序列分別如Seq No.2、Seq No.3與Seq No.4所示，分別以Qa1-G₄S-FLAG即Seq No.5、PDL1-G₄S-FLAG即Seq No.6、HLAE-G₄S-FLAG即Seq No.7融合蛋白的形式進行表達。

2.根據權利要求1所述的用于抗器官移植排斥反應的脂質體，其特征在于：所述鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體按VL-(G₄S)₃-VH-G₃S-SA-GFP的方式合成全長。

3.根據權利要求1所述的用于抗器官移植排斥反應的脂質體，其特征在于：所述生物素化的Qa-1、生物素化PD-L1與生物素化的HLA-E中Qa-1、PD-L1、HLA-E與Sulfo-NHS-Biotin的摩爾比均為1:3～1:5。

4.一種權利要求1至3任一項所述的用于抗器官移植排斥反應的脂質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步，攜帶掛載位點的脂質體制備

分別按照比例稱取磷脂酰膽堿10mg～100mg、膽固醇1mg～10mg、0.1～1mg神經節苷脂GM2，室溫在氯仿/甲醇溶液中過夜震蕩溶解，抽干有機溶劑使之形成均勻的脂質體膜，充干燥氣體使殘余有機溶劑充分揮發；加入pH＝6.5的PBS溶液震蕩至膜充分溶解，超聲至脂質體溶液分散為均勻、穩定的透明液體，得到人工脂質體；

第二步，神經節苷脂GM2的單鏈抗體-鏈霉親和素融合蛋白表達純化

鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體按VL-(G₄S)₃-VH-G₃S-SA-GFP的方式合成全長，蛋白質的表達采用ExpiCHO系統，將GM2的單鏈抗體-鏈霉親和素融合蛋白克隆至pcDNA3.4載體后，轉染CHO細胞，振蕩培養，收集細胞懸液；離心后使用等體積PBS稀釋；鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體使用亞氨基生物素瓊脂糖珠純化；

第三步，掛載元件的表達純化

掛載元件包括Qa-1胞外段、PD-L1胞外段和HLA-E胞外段，3個掛載元件分別以Qa1-G₄S-FLAG即Seq No.5、PDL1-G₄S-FLAG即Seq No.6與HLAE-G₄S-FLAG即Seq No.7融合蛋白的形式進行表達，將以上三個融合蛋白克隆至pcDNA3.4載體后，轉染CHO細胞，振蕩培養，收集細胞懸液，離心后使用等體積PBS稀釋，掛載元件連接FLAG標簽與人IgG1Fc段；所有蛋白均使用OptiCHO^TMExpress系統分泌表達，掛載元件使用Protein A柱進行第一輪純化，完成純化后使用Tris-HCl中和pH值至8.0，使用腸激酶切除Fc端，按0.2U腸激酶/1mg總蛋白25℃過夜酶切，酶切產物使用FLAG親和柱進行二次親和純化；純化產物使用Tris-HCl中和至pH＝7.5，使用35kDa超濾管濃縮蛋白；

第四步，掛載元件的生物素化

對第三步制備的掛載元件定量后，將掛載元件肽段與Sulfo-NHS-Biotin按摩爾比1:3～1:5在pH＝8.5PBS中室溫反應，使用10kDa透析袋去除未結合的Sulfo-NHS-Biotin，超濾濃縮生物素化的掛載元件，獲得生物素化的掛載元件；

第五步，脂質體藥物裝載

第一步制備的人工脂質體中加入第二步制備的鏈霉親和素偶聯的GM2單鏈抗體，濃度為0.1～1ng/μL，4℃顛倒混勻過夜；

將第三步制備的生物素化的Qa-1或HLA-E與PD-L1等摩爾混合后，按100:1～200:1的摩爾比與上述脂質體混合，室溫顛倒混勻，透析去除未結合蛋白，完成脂質體制備。