[發明專利]一種細胞規模化培養方法、純化方法及細胞信使

在審

• 申請號: 201910405915.3
• 申請日: 2019-05-15
• 公開（公告）號: CN110093312A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 張永國;何君
• 申請（專利權）人: 張永國
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

本發明提供了一種細胞的規模化培養方法，包括：將待培養細胞與滅菌后的GE微載體接種于含血清的培養基，在生物培養器中培養至高密度，然后換成無血清培養基，在無血清培養基中繼續培養4?7d，收集上清液即可。該培養方法操作簡單，操作條件比較溫和，細胞成活率高，為后續細胞規模化的培養提供了參照方法，值得廣泛推廣應用。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，具體而言，涉及一種細胞規模化培養方法、細胞信使及純化方法。

背景技術

每個成人體內，大約含有300億個白色脂肪，功能是將能量以脂肪細胞的形式儲存起來。每個脂肪細胞中，都含有三酸甘油脂，俗稱脂肪球。脂肪球量變大，脂肪細胞體積就擴增，造成肥胖；反之燃燒三酸甘油脂，細胞萎縮身材就瘦下來了。在正常情形下，脂肪細胞數目到了青春期后就不再增加。身體脂肪的分布，部分取決于遺傳及荷爾蒙等影響，例如女性的皮下脂肪多積聚于小腹、臀部及大腿，而男性則囤積于上腹及腰部。

臍帶間充質細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，具有廣闊的臨床應用前景。應用滅活臍帶血清培養體系可成功擴增人臍帶間充質干細胞，培養的細胞具有間充質干細胞的基本特性，為建立間充質干細胞庫和臨床應用提供了理論依據。

微載體指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。

微載體應用的原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

現有技術中的微載體培養細胞的方法工藝復雜，操作條件苛刻，細胞成活率不高，接種密度低，而且對微載體本身的要求高，需要采用專用型的微載體才能保證細胞培養的正常進行，間接提高了操作成本，限制了微載體的應用面。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種細胞規模化的培養方法，上述培養方法操作簡單，操作條件比較溫和，細胞成活率高，為后續細胞規模化的培養提供了可供參照的方法，值得廣泛推廣應用。

本發明的第二目的在于提供一種細胞特定的純化方法，純化后為天然非重組結構特性，純度高，且其模擬體內的最適比例濃度協同作用，調控細胞增殖、分化、維持組織和細胞有序生長發育，膠原蛋白、纖連蛋白、超氧化物歧化酶等蛋白質是維持肌膚年輕態的關鍵成分，純化得到產物應用非常廣泛。

本發明的第三目的在于提供上述培養方法得到的細胞信使，通過采用本發明的培養方法獲得的細胞信使不僅活性好，培養獲得的每種類型的細胞信使功能性均比較強，而且該方法本身操作簡單，操作條件比較溫和，細胞成活率高，為后續細胞規模化的培養提供了可供參照的方法，值得廣泛推廣應用。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明提供了一種細胞規模化的培養方法，包括如下步驟：將待培養細胞與滅菌后的GE微載體接種于含血清的培養基，在生物培養器中培養至高密度，然后換成無血清培養基，在無血清培養基中繼續培養4-7d，收集上清液即可。

所述待培養細胞為臍帶間充質細胞、脂肪細胞中的一種或兩種；

優選地，所述待培養細胞的接種密度為(8-9)*10³cell/ml；

更優選地，所述待培養細胞的接種密度為8.6*10³cell/ml。