[發明專利]一種基于CRISPR技術的基因檢測方法及試劑盒與應用

在審

• 申請號: 201910405904.5
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN111944879A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 周小明;王徐升
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司 44425
• 代理人: 吳靜芝

本發明公開了一種基于CRISPR技術的基因檢測方法，其主要步驟包括：(1)目的基因的引物設計及擴增；(2)sgRNA的設計、轉錄和純化；(3)Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物的制備；(4)信號探針的制備；(5)檢測載體的制備；(6)樣品的檢測與結果讀取。本發明還包括兩種基于所述檢測方法的試劑盒及其應用。本發明可以實現精準的基因檢測，結果穩定，并且雜交探針通用，操作簡單，特異性極高，方便推廣。

技術領域

本發明涉及生物技術檢測領域，尤其涉及一種基于CRISPR技術的基因檢測方法及試劑盒與應用。

背景技術

近年來用于基因檢測的核酸試紙條得到不斷發展，為實現定點簡便的核酸檢測提供了一種很有前景的方法。它的原理是基于三明治氏核酸雜交反應，結合金納米粒子或者其他納米顆粒以及酶聯免疫法等在側向流動試紙條上實現比色檢測。已報道的方法中結合核酸擴增方法如非對稱PCR擴增以及其他恒溫擴增方法，以得到一種單鏈DNA或RNA產物，與預先設計好包埋在試紙條上的T線和C線探針特異性雜交并且利用底物顯色而達到檢測效果。然而，這種方法不具有廣普性，針對不同的檢測物需要設計不同的特異性雜交探針，而且擴增設計相對復雜，易出現假陽性且特異性不強的問題。

CRISPR技術是近年來發展的一種基因組工程學工具，該工具已經徹底革新了生命科學領域，在生物醫學、農業等領域具有極大的應用前景。它的強大之處在于它能夠對基因進行指定位置的精確編輯。具體來說，在Cas蛋白和向導RNA的共同作用下，細胞基因組DNA或其他外源DNA可以被精確剪切。被CRISPR/Cas系統剪切需要滿足以下幾個條件。首先，被編輯的基因區域需要存在相對保守的PAM序列(前間隔序列鄰近基序)。其次，向導RNA要和PAM上游的序列堿基(一般20個堿基左右)互補配對。Cas蛋白在和向導RNA結合后，會搜尋基因序列，當識別到指定的序列，便可以靶向上去進行特定位點切割。通過對這種向導RNA的設計以及對PAM位點的甄別，可以實現單堿基分辨率的基因檢測。并且，整個過程只需要在恒溫37℃條件下反應15-30min即可。但是目前利用CRISPR技術來進行基因檢測的方法大都利用熒光定量的方法來實現，這種方法依賴昂貴的儀器來實現，不適用于資源有限的地區使用。

近期研究發現，DNA在被Cas9蛋白剪切后，只會在特定位點斷開，但并不會從Cas9-sgRNA結構中脫離。類似的還有dCas9蛋白，它雖然沒有切割DNA的能力，但仍能夠在sgRNA的引導下與特定DNA序列結合。對于Cas12a蛋白，在將目標DNA區域剪切完之后，PAM遠端的DNA片段脫離，而PAM近端的DNA片段仍然結合在蛋白-crRNA復合結構中。本發明基于此設計了一種結合CRISPR技術的核酸紙芯片基因檢測技術。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述現有技術的缺點和不足，提供一種基于CRISPR技術的基因檢測方法及其試劑盒與應用。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種基于CRISPR技術的基因檢測方法，具體包括以下步驟：

(1)目的基因的引物設計及擴增。

根據目的基因設計兩條引物，其中一條引物的一端修飾有功能基團，然后以待測樣品的基因組DNA或RNA為模板進行擴增。所述的功能基團可以為生物素等。所述的擴增方法可以為PCR、RPA或LAMP等方法。

(2)sgRNA的設計、轉錄和純化。

首先設計sgRNA體外轉錄所需DNA模板的PCR擴增引物，其中上游引物包含有T7啟動子區和20-nt的與靶DNA相關序列等，下游引物主要用于編碼sgRNA的3’末端序列；

然后通過PCR擴增得到sgRNA轉錄模板DNA，經PCR產物純化試劑盒純化后用于T7RNA聚合酶介導的轉錄反應，從而體外轉錄出sgRNA。得到的sgRNA產物用RNA純化試劑盒純化，純化后的sgRNA凍存在-80℃以備使用。