[發明專利]一種基于CRISPR技術的基因檢測方法及試劑盒與應用

在審

• 申請號: 201910405904.5
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN111944879A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 周小明;王徐升
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司 44425
• 代理人: 吳靜芝

1.一種基于CRISPR技術的基因檢測方法，具體包括以下步驟：

(1)目的基因的引物設計及擴增；根據目的基因設計兩條引物，其中一條引物的一端修飾有功能基團，然后以待測樣品的基因組DNA或RNA為模板進行擴增；

(2)sgRNA的設計、轉錄和純化；

(3)Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物的制備；所述Cas蛋白為Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步驟(2)得到，所述靶標為步驟(1)得到的修飾有功能基團的擴增產物；

(4)信號探針的制備；所述信號探針為可以被探測到信號的分子標記物、酶或者納米顆粒，所述信號探針能夠與步驟(3)所述Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物結合；

(5)檢測載體的制備；所述檢測載體為側向流或垂直流載體，且檢測載體的檢測線或點上包被有能夠與步驟(1)所述功能基團牢固結合的物質；

(6)樣品的檢測與結果讀取；將步驟(3)所述的Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物通過步驟(5)所述檢測載體進行檢測，如果檢測線或點檢測到所述信號探針相應的信號，則待測樣品中含有目的基因，否則待測樣品中不含目的基因。

2.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的信號探針與第一特定DNA序列共價或非共價結合從而得到被標記的DNA-信號探針，所述第一特定DNA序列與步驟(1)所述的擴增產物存在部分互補序列，使所述DNA-信號探針能夠與Cas/sgRNA復合物識別解旋的擴增產物的非靶向鏈雜交結合，從而使信號探針能夠結合到Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物上。

3.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的信號探針可以與步驟(2)所述的sgRNA發生共價或非共價偶聯，從而使其能夠結合到Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物上。

4.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述sgRNA的莖環結構的環區域添加有一段序列，步驟(4)所述的信號探針與第二特定DNA序列共價或非共價結合從而得到被標記的DNA-信號探針，所述第二特定DNA序列與所述sgRNA莖環結構處的添加序列存在部分互補序列，使所述DNA-信號探針能夠與sgRNA結合，從而使信號探針能夠結合到Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物上。

5.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的信號探針可以與步驟(3)所述的Cas蛋白共價或者非共價偶聯，從而使其能夠結合到Cas蛋白/sgRNA/靶標復合物上。

6.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述側向流檢測載體為試紙條，所述試紙條由底板樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和底板組成，硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，且檢測線靠近結合墊、質控線靠近吸水墊，所述檢測線上包被有能夠與步驟(1)所述功能基團牢固結合的物質，所述質控線上包被有能夠與步驟(4)所述信號探針牢固結合的捕獲探針。

7.根據權利要求1所述的基于CRISPR技術的基因檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述垂直流檢測載體為紙芯片，所述紙芯片上陣列的設有檢測點，所述檢測點上包被有能夠與步驟(1)所述功能基團牢固結合的物質。