[發(fā)明專(zhuān)利]在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸及其篩選方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910405276.0
• 申請(qǐng)日: 2019-05-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110157705B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華益民
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州安天圣施醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12Q1/686;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇科專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 蔣慧妮

1.在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用，所述反義寡核苷酸在PDCD1基因表達(dá)的mRNA前體剪接水平抑制PD-1信號(hào)； 所述反義寡核苷酸為促進(jìn)外顯子3跳躍而抑制 PD-1 信號(hào)的反義寡核苷酸；所述反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)存在于所述PDCD1基因的外顯子3中，且該作用靶點(diǎn)為PDCD1外顯子3上從第12位核苷酸至第45位核苷酸的一段序列，其序列為SEQ ID NO.1所示。

2.如權(quán)利要求1中所述的在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)的篩選方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、構(gòu)建PDCD1小基因；

S2、尋找確認(rèn)S1中PDCD1小基因中的兩個(gè)外顯子剪接增強(qiáng)子；

S3、初步篩選反義寡核苷酸；

S4、在初步篩選的反義寡核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化；

其中，所述S3和S4的初步篩選、優(yōu)化均采用步移法進(jìn)行。

3.如權(quán)利要求2所述的在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)的篩選方法，其特征在于：所述S1中包括如下步驟，

S11、設(shè)計(jì)引物，將人基因組DNA中PDCD1基因片段克隆到質(zhì)粒pCI-neo構(gòu)建PDCD1小基因，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性；所述PDCD1小基因序列為SEQ ID NO.2所示；

S12、將表達(dá)PDCD1小基因的質(zhì)粒用支鏈聚乙烯亞胺（branched polyethylenimine）試劑轉(zhuǎn)入各種細(xì)胞檢測(cè)其剪接模式，發(fā)現(xiàn)外顯子3的列入和跳躍是PDCD1小基因的主要可變剪接模式。

4.如權(quán)利要求2所述的在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)的篩選方法，其特征在于：所述S2包括如下步驟，

S21、對(duì)S1中PDCD1小基因中156nt的外顯子3做序列刪除分析，每個(gè)突變體刪除12nt，構(gòu)建13個(gè)突變體，由于第一個(gè)和最后一個(gè)突變體刪除了部分3′和5′剪接位點(diǎn)序列，為避免剪接位點(diǎn)受損造成的影響，在13個(gè)突變體的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充兩個(gè)不影響剪接位點(diǎn)的刪除突變體；

S22、將構(gòu)建的野生型PDCD1小基因和突變體共16個(gè)質(zhì)粒用支鏈聚乙烯亞胺法轉(zhuǎn)入A375細(xì)胞進(jìn)行RNA剪接分析，跟野生型相比，其中兩個(gè)不涉及剪接位點(diǎn)刪除的突變體強(qiáng)烈抑制PDCD1外顯子3列入，從而確認(rèn)這兩個(gè)突變體所刪除的序列包含剪接增強(qiáng)子，分別為D13-24刪除位點(diǎn)的增強(qiáng)子，和D133-144刪除位點(diǎn)的增強(qiáng)子。

5.如權(quán)利要求2所述的在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)的篩選方法，其特征在于：所述S3包括如下步驟，

S31、首先設(shè)計(jì)16個(gè)15nt長(zhǎng)的反義寡核苷酸，靶點(diǎn)覆蓋一段長(zhǎng)165nt的序列：內(nèi)含子2最后5nt、整個(gè)156nt 外顯子3和內(nèi)含子3的前4nt；每個(gè)ASO與前一個(gè)ASO存在5nt 的重疊；每個(gè)ASO分別與PDCD1小基因共轉(zhuǎn)染到A375細(xì)胞，觀(guān)察ASO對(duì)外顯子3剪接的影響；從細(xì)胞收集的RNA樣品用熒光RT-PCR方法分析全長(zhǎng)mRNA和缺乏外顯子3 mRNA豐度的變化，計(jì)算外顯子3的列入百分比，結(jié)果顯示作用靶點(diǎn)為外顯子3從16位到40位的一段序列的兩條ASO能顯著抑制外顯子3的列入，且兩條所述的ASO作用于D13-24刪除位點(diǎn)的增強(qiáng)子及其下游序列，靶點(diǎn)序列含64%的C，提示C-豐富序列是剪接增強(qiáng)子的關(guān)鍵序列；

S32、進(jìn)一步對(duì)S31中兩個(gè)ASO進(jìn)行劑量依賴(lài)性反應(yīng)分析，對(duì)其抑制PDCD1外顯子3剪接的抑制強(qiáng)度確認(rèn)；

S33、選擇兩個(gè)ASO中效果較好的ASO，在人B淋巴細(xì)胞來(lái)源的RPMI 8226細(xì)胞檢測(cè)并確認(rèn)其對(duì)內(nèi)源基因PDCD1剪接的影響。

6.如權(quán)利要求2所述的在PDCD1基因表達(dá)的剪接水平抑制PD-1信號(hào)的反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)的篩選方法，其特征在于：所述S4包括如下步驟，

S41、在作用位點(diǎn)覆蓋外顯子3序列從11位到45位中，設(shè)計(jì)共20個(gè) 20nt和18nt長(zhǎng)的ASO，相鄰ASO移動(dòng)一個(gè)位置，以100 nM為終濃度，將每個(gè)ASO分別與PDCD1小基因共轉(zhuǎn)染，觀(guān)察ASO對(duì)外顯子3剪接的影響，除了覆蓋外顯子3從11位到30位的序列沒(méi)有效果，其他ASO都顯著抑制外顯子3的列入，因此確認(rèn)12位至45位是ASO的有效作用區(qū)域，挑選出六個(gè)強(qiáng)烈抑制外顯子3列入的ASO；

S42、進(jìn)一步對(duì)以上S41挑選出的ASO進(jìn)行了劑量依賴(lài)效應(yīng)分析，并以不相關(guān)ASO為對(duì)照，再次確認(rèn)六個(gè)ASO都能顯著抑制外顯子3的列入，其中覆蓋外顯子3從22位到41位的序列效果最好。