[發明專利]基于CRISPR-Cas去除宿主基因組DNA的宏基因組提取方法

在審

• 申請號: 201910405034.1
• 申請日: 2019-05-15
• 公開（公告）號: CN110205318A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 歐陽川;韓序;王珺;賈天梅
• 申請（專利權）人: 杭州杰毅生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/113;C12N9/22
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.一種基于CRISPR-Cas去除宿主基因組DNA的宏基因組提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從來源于宿主的樣本中提取宏基因組總核酸，得到包含宿主基因組DNA的宏基因組核酸樣品；

(2)將帶有生物素標記的核酸內切酶活力缺失的Cas蛋白或其變體蛋白與多個聚簇規則間隔短回文重復RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)或crRNA/tracrRNA衍生物在緩沖液中混合孵育，形成穩定的CRISPR-Cas系統組合物；

(3)將步驟(2)孵育好的CRISPR-Cas系統組合物與步驟(1)的包含宿主基因組DNA的宏基因組核酸樣品混合，在緩沖液中反應；用包被有鏈霉親和素的磁珠捕獲CRISPR-Cas系統組合物和其結合的宿主基因組DNA，形成磁珠-蛋白-RNA-DNA復合物；用磁力架分離去除磁珠-蛋白-RNA-DNA復合物，達到消減樣品溶液中的宿主基因組DNA濃度的目的。

2.根據權利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系統組合物包括：

(1)至少一種作用于雙鏈DNA的II型(Class II)Cas蛋白或其衍生物，包括：第二亞型(Type II)的Cas9蛋白、第五亞型(Type V)的Cas12a或Cas12b蛋白；

(2)一條/組或多條/組靶向于宿主基因組DNA中重復序列Alu元件特定區域的單鏈RNA或雙鏈RNA復合物，包括以下形式：

(a)至少一條單鏈crRNA，適用于Cas12a或其變體蛋白；或

(b)至少一組crRNA和tracrRNA組成的雙鏈RNA復合物，適用于Cas9和Cas12b或其變體蛋白；或

(c)至少一條單鏈crRNA/tracrRNA衍生物，適用于Cas9和Cas12b或其變體蛋白。

3.根據權利要求1或2所述的宏基因組提取方法，其特征在于，所述crRNA、crRNA/tracrRNA衍生物包含與宿主基因組DNA中重復序列Alu元件特定區域的正義鏈或反義鏈靶DNA互補的特異性核苷酸序列。

4.根據權利要求1或2所述的宏基因組提取方法，其特征在于，所述tracrRNA部分序列能夠與crRNA互補配對，與crRNA形成具有特定二級結構的雙鏈RNA復合物，用于與Cas9和Cas12b蛋白或其變體蛋白形成穩定的CRISPR-Cas系統組合物。

5.根據權利要求1或2所述的宏基因組提取方法，其特征在于，所述crRNA/tracrRNA衍生物，是一條或多條融合有crRNA序列和tracrRNA序列的單鏈向導RNA(sgRNA)，其序列包含：

(1)至少一種向導序列，該向導序列能夠與宿主基因組DNA中重復序列Alu元件特定區域的正義鏈或反義鏈靶DNA互補，和

(2)至少一種反式激活crRNA(tracrRNA)互補配對序列，和

(3)至少一種tracrRNA序列，

并且上述(1)、(2)和(3)按順序以5’到3’方向排列時可以與Cas9蛋白形成穩定的CRISPR-Cas系統組合物；而當(3)、(2)和(1)按順序以5’到3’方向排列時可以與Cas12b蛋白形成穩定的CRISPR-Cas系統組合物。

6.根據權利要求1或2所述的宏基因組提取方法，其特征在于，所述Cas9蛋白包含一種或多種天然的或工程化的Cas9酶，這些酶包括不同物種來源的Cas9以及這些蛋白的不同物種來源的野生型、改造過的、密碼子優化過的、進化過的、嗜熱的、嵌合的、工程化的和/或一種以上Cas蛋白的混合物；所述Cas9蛋白既可以利用crRNA和tracrRNA組成穩定的CRISPR-Cas系統組合物，也可以利用sgRNA組成穩定的CRISPR-Cas系統組合物。