[發(fā)明專利]基于CRISPR-Cas去除宿主基因組DNA的宏基因組提取方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910405034.1 | 申請日： | 2019-05-15 |
| 公開（公告）號： | CN110205318A | 公開（公告）日： | 2019-09-06 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 歐陽川;韓序;王珺;賈天梅 | 申請（專利權(quán)）人： | 杭州杰毅生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12N15/113;C12N9/22 |
| 代理公司： | 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246 | 代理人： | 黎雙華 |
| 地址： | 310030 浙江省杭州市西湖區(qū)三墩鎮(zhèn)*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 宿主基因組 宏基因組 核酸內(nèi)切酶 去除 蛋白 鏈霉親和素 生物素標記 變體蛋白 測序數(shù)據(jù) 樣品溶液 元件區(qū)域 重復序列 宿主DNA 靶序列 包被 變體 測序 磁珠 豐度 核酸 消減 捕獲 微生物 | ||
本發(fā)明公開了一種基于CRISPR?Cas系統(tǒng)組合物特異減少或去除宿主基因組DNA的宏基因組提取方法。本發(fā)明旨在提供一種在宏基因組測序中降低宿主基因組DNA背景、提高其余微生物有效測序數(shù)據(jù)的技術(shù)。所述方法中的CRSIPR?Cas系統(tǒng)包括多個crRNA或crRNA/tracrRNA衍生物、以及帶有生物素標記的核酸內(nèi)切酶活力缺失的Cas蛋白或其變體蛋白。crRNA或crRNA/tracrRNA衍生物的序列與宿主基因組DNA中的重復序列Alu元件區(qū)域(靶序列)互補，借此引導核酸內(nèi)切酶活力缺失的Cas蛋白或其變體結(jié)合在宿主基因組DNA上，再通過加入包被有鏈霉親和素的磁珠捕獲CRISPR?Cas系統(tǒng)和其結(jié)合的宿主DNA，以此消減樣品溶液中的宿主基因組DNA的濃度，并提高其他非宿主基因組DNA的核酸的豐度。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于宏基因組檢測領(lǐng)域，具體地涉及CRISPR技術(shù)和消減宏基因組核酸樣品中宿主基因組DNA的方法。
背景技術(shù)
成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)系統(tǒng)是細菌和古細菌在不斷進化的過程中產(chǎn)生的適應性的免疫防御機制，用來保護自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一套適應性免疫系統(tǒng)，他應用CRISPR RNA(crRNA)以堿基互補的形式引導Cas蛋白識別入侵的外源基因組，并對其DNA進行剪切。根據(jù)Cas蛋白的序列和結(jié)構(gòu)將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)都需要多個Cas蛋白原件，而Ⅱ型僅僅需要一個Cas蛋白作為效應蛋白。
這其中Cas9蛋白是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)中一種最典型的蛋白，當與稱為CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的兩個RNA組合復合物時，可以發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，從而切斷入侵噬菌體或質(zhì)粒中的外源DNA，以保護宿主細胞。crRNA從宿主基因組中的CRISPR元件轉(zhuǎn)錄而來，其中該CRISPR元件之前包含有捕獲的外源DNA。另外，通過人工融合crRNA和tracrRNA中的必要部分核苷酸而產(chǎn)生的嵌合sgRNA(單鏈向?qū)NA)可以取代CRISPR-Cas系統(tǒng)組合物中的兩個RNA成分，也能形成功能性地核酸內(nèi)切酶。Cas9蛋白復合物能夠識別的靶標DNA需要具備間隔序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)。PAM的序列是較保守的，具體序列取決于Cas9的種類，如來源于化膿鏈球菌的SpCas9可以識別的PAM序列為5’-NGG-3’，其中N可以是A、G、C或T中的任意一種。
2015年新發(fā)現(xiàn)的Cas12a(之前被稱為Cpf1)是另一種II型CRISPR/Cas系統(tǒng)中如今被廣泛應用的蛋白。這一新發(fā)現(xiàn)的Cas12a系統(tǒng)有幾個重要的特點不同于以往描述的Cas9：1)Cas12a系統(tǒng)更簡單一些，它只需要一條較短的crRNA，不再需要tracrRNA；2)Cas12a酶也比標準SpCas9要小，使得它更易于傳送至細胞和組織內(nèi)；3)Cas12a以一種不同于Cas9的方式切割DNA。當Cas9復合物切割DNA時，它切割的是同一位點的兩條鏈，留下的是平末端切口。采用Cas12a復合物生成的兩條鏈切口是粘性末端，在裸露端留下了短垂懸；4)Cas12a復合物識別的靶標DNA位于PAM區(qū)下游，并且其切口遠離識別位點。來源于毛螺科菌的LbCas12a和來源于嗜酸鏈球菌的AsCas12a是其中較典型的蛋白，其可以識別的PAM序列為5’-TTTV-3’，其中V可以是A、G或C中的任意一種。而來源于弗朗西絲氏菌屬的FnCas12a可以識別更為寬松的PAM序列5’-TTN-3’。
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