[發(fā)明專利]一種細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910404770.5 | 申請日： | 2019-05-16 |
| 公開（公告）號： | CN110272870A | 公開（公告）日： | 2019-09-24 |
| 發(fā)明（設計）人： | 邢永梅;鄧蒙蒙;程簫;劉丹;吳疆;王保如 | 申請（專利權）人： | 安徽瑞達健康產(chǎn)業(yè)有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0783 | 分類號： | C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00 |
| 代理公司： | 合肥方舟知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 34158 | 代理人： | 劉躍 |
| 地址： | 230000 安徽省合肥市高新區(qū)*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 細胞組合物 治療 癌細胞 應用 殺傷 擴增 誘導 癌癥 疾病 | ||
1.一種細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：γδT細胞和NK細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：γδT細胞和NK細胞比例為1：0.5-10。
3.根據(jù)權利要求2所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：γδT細胞和NK細胞制備方法如下：
(1)γδT細胞的獲得；
(2)NK細胞的獲得；
(3)γδT細胞和NK細胞混合細胞物誘導擴增共培養(yǎng)；
(4)15-20天γδT細胞和NK細胞混合細胞的獲得。
4.根據(jù)權利要求3所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：γδT細胞的獲得方法為：
(1)單個核細胞的制備：分離單個核細胞，用含體積百分比50％-100％的含10vt％FBS或自體血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培養(yǎng)基重懸細胞，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；
(2)γδT細胞的誘導：加入含濃度為1-100μM的唑來膦酸和500～3000U/mL IL-2的混合培養(yǎng)基體外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mL anti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培養(yǎng)基進行半量換液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)培養(yǎng)2～3天，待γδT細胞生長狀態(tài)良好待后續(xù)使用。
5.根據(jù)權利要求3所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：NK細胞的獲得包括如下步驟：(1)分離單個核細胞；
(2)通過免疫分選去除單個核細胞中的CD3+T淋巴細胞；
(3)加入NK細胞培養(yǎng)用無血清細胞培養(yǎng)基及終濃度為10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2接種在細胞培養(yǎng)瓶體外培養(yǎng)2-5天后全換液，待細胞生長狀態(tài)良好。
6.根據(jù)權利要求3所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：γδT細胞和NK細胞混合細胞物共培養(yǎng)包括如下步驟：
(1)取單獨培養(yǎng)中生長狀態(tài)良好的γδT細胞適量，并放置于培養(yǎng)瓶中；
(2)取單獨培養(yǎng)中生長狀態(tài)良好的NK細胞適量，并放置于上述步驟(1)γδT細胞培養(yǎng)瓶中；
(3)向培養(yǎng)瓶中加入自體血清的RMPI 1640和X-vivo15培養(yǎng)基1-2天；
(4)2-3天向細胞培養(yǎng)瓶中加入10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2的混合培養(yǎng)基進行半量換液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)第5天-第18天，每天觀察細胞生長狀態(tài)，補加含細胞因子的自體血清的RMPI1640和X-vivo15培養(yǎng)基，維持細胞濃度1×106cells/ml，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，至達到所需細胞數(shù)量時收獲細胞；如果細胞體積超過240ml，則分瓶培養(yǎng)或轉入細胞培養(yǎng)袋中傳代培養(yǎng)，14-18天收獲混合細胞培養(yǎng)物。
7.根據(jù)權利要求4-6任一項所述細胞組合物在癌細胞NCI-H1975上的應用，其特征在于：RMPI 1640和X-vivo15的比例為1：0.5-5。
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