[發明專利]一種用于畢赤酵母表達宿主的多基因敲入方法

有效

• 申請號: 201910403132.1
• 申請日: 2019-05-15
• 公開（公告）號: CN110079546B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 蔡孟浩;劉啟;師曉娜;張元興
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12N15/10;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種用于畢赤酵母表達宿主的多基因敲入方法。針對畢赤酵母缺乏高效的靶向性敲入技術的問題，本發明提供了合適的gRNA靶點。應用本發明的方法進行基因組改造后的畢赤酵母，其生長代謝不受影響。所述方法能夠高效地實現多個基因的快速敲入，且可以進行篩選標記的回收，為畢赤酵母異源合成天然產物提供強有力的工具。

技術領域

本發明屬于基因改造技術領域；更具體地，本發明涉及一種基于CRISPR/Cas9技術的無篩選標記多基因一步敲入的方法。

背景技術

畢赤酵母表達系統已被較為廣泛地用于重組蛋白的表達和藥用化合物的合成。目前，以畢赤酵母為底盤細胞已成功合成六甲基水楊酸、桔霉素、土曲霉酸、洛伐他汀、莫納克林J等藥用化合物或中間體，表現出巨大的應用前景和生產潛力。

畢赤酵母作為異源表達宿主具有諸多優勢，但其同源重組效率相對釀酒酵母較低，導致其重組菌株構建難度較大，篩選效率不高。特別在以畢赤酵母為底盤細胞，進行多酶途徑的組裝時，重組菌株篩選標記不足，構建周期長等問題尤為突出。因此，在畢赤酵母中開發一套高效、無篩選標記的基因敲入方式，對于畢赤酵母在多酶途徑合成方面非常重要。

CRISPR/Cas9系統自發展以來，已實現植物、線蟲、果蠅、酵母、小鼠、斑馬魚等多個物種的基因編輯。該系統操作簡單，特異性高，便于基因改造。Cas9在gRNA介導下對目標位點進行切割，形成DNA雙鏈斷裂(DSB)。DSB主要有兩種修復方式，非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)。其中非同源末端連接在DSB附近發生堿基突變、缺失、隨機插入，而同源重組需要含同源臂的供體DNA的參與，修復過程精確。

此外，同時表達多種gRNA實現多位點突變或多基因敲入，是提高CRISPR技術的工作效率的一種捷徑，目前畢赤酵母內尚無多基因一步敲入方法的報道。

如果能夠開發一套基于CRISPR/Cas9技術無篩選標記的多基因一步敲入技術，更高效地實現基因敲入，縮短構建周期，這對于畢赤酵母中多酶途徑的組裝具有積極意義。但由于畢赤酵母基因組復雜，不合適的基因改造的位點的運用往往導致其生長或代謝出現問題。

因此，本領域亟待找到在不影響畢赤酵母生長代謝的基礎上，具有高效性的靶向操作位點，更特別地能夠相互配合且敲入效率較高的多基因同時敲入位點。

發明內容

本發明的目的在于提供基于CRISPR技術的畢赤酵母多基因一步敲入方法。

在本發明的第一方面，提供一種對畢赤酵母的基因組進行定向基因敲入方法，所述方法包括：

(1)提供畢赤酵母，該畢赤酵母中KU70功能被下調或缺失；

(2)將一個或多個(如1～5個，進一步如2、3、4種)gRNA表達盒、與之相應的一個或多個(如1～5個，進一步如2、3、4種)供體構建物引入(1)的畢赤酵母中，同時還引入Cas9表達盒；

其中，所述gRNA靶向于gRNA靶點，所述gRNA靶點位于畢赤酵母基因組的基因啟動子的上游100bp以內或者終止子的下游100bp以內；

其中，所述供體構建物包含操作性連接的：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂；

(3)培養(2)的畢赤酵母，其基因組中發生一個或多個位置上的基因敲入。

在一個優選例中，所述的外源基因敲入包括：將外源基因設置于所述的“外源的基因操作序列”中，從而當將該基因操作序列被替換入細胞基因組后，該外源基因被定向地敲入到細胞基因組中。