[發(fā)明專利]一種用于畢赤酵母表達宿主的多基因敲入方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910403132.1 | 申請日： | 2019-05-15 |
| 公開（公告）號： | CN110079546B | 公開（公告）日： | 2022-10-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 蔡孟浩;劉啟;師曉娜;張元興 | 申請（專利權）人： | 華東理工大學 |
| 主分類號： | C12N15/81 | 分類號： | C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12N15/10;C12R1/84 |
| 代理公司： | 上海專利商標事務所有限公司 31100 | 代理人： | 陳靜 |
| 地址： | 200237 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 用于 酵母 表達 宿主 多基因 方法 | ||
1.一種對畢赤酵母的基因組進行定向基因敲入方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 提供畢赤酵母，該畢赤酵母中
(2) 將一個或多個gRNA表達盒、與之相應的一個或多個供體構建物引入(1)的畢赤酵母中，同時還引入Cas9表達盒；
其中，所述gRNA靶向于gRNA靶點，所述gRNA靶點位于畢赤酵母基因組的基因啟動子的上游100 bp以內或者終止子的下游100 bp以內；所述的啟動子為GAP啟動子、TEF1-α啟動子、AOX1啟動子或FLD啟動子；所述終止子為AOXTT終止子；
其中，所述供體構建物包含操作性連接的：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂；
(3) 培養(yǎng)(2)的畢赤酵母，其基因組中發(fā)生一個或多個位置上的基因敲入。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA靶點選自SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5的gRNA靶點。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，在無篩選壓力的培養(yǎng)基中培養(yǎng)畢赤酵母，使質粒丟失，實現(xiàn)篩選標記的回收；或
所述的畢赤酵母為His營養(yǎng)缺陷型畢赤酵母。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多個基因為：(a)多個不同基因，(b)多個相同基因，或(a)與(b)的組合。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA表達盒、Cas9表達盒采用雙向啟動子表達，稱為gRNA-Cas9；或
所述的Cas9表達盒中，Cas9的編碼基因具有密碼子優(yōu)化序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO: 67所示。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂、3’同源臂為畢赤酵母基因組中所述gRNA靶點兩端的序列。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂、3’同源臂長度為200 bp～2000 bp。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的gRNA表達盒中，在gRNA編碼序列兩端還包括自切割酶。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的自切割酶為HH核酶和/或HDV核酶。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，在gRNA編碼序列方兩端分別連接HH核酶和HDV核酶。
11.用于對畢赤酵母的基因組進行定向基因敲入的構建體，其特征在于，所述構建體包括：
(i) 一個或多個gRNA表達盒，所述gRNA靶向于gRNA靶點，所述gRNA靶點位于畢赤酵母基因組的基因啟動子的上游100 bp以內或者終止子的下游100 bp以內；所述的啟動子為GAP啟動子、TEF1-α啟動子、AOX1啟動子或FLD啟動子；所述終止子為AOXTT終止子；
(ii) 與(i)中gRNA表達盒相應的一個或多個供體構建物，所述供體構建物包含操作性連接的：5’同源臂、外源的基因操作序列的插入位點、3’同源臂；
(iii) Cas9表達盒。
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