[發明專利]一種氧化石墨烯親和固定化載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201910387766.2
• 申請日: 2019-05-10
• 公開（公告）號: CN110028063B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 應漢杰;莊偉;朱倩倩;周文鳳;吳菁嵐;朱晨杰;楊朋朋
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C01B32/198
• 分類號: C01B32/198;C01B32/194;C12N11/14
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種氧化石墨烯親和固定化載體及其制備方法與應用，該親和載體的制備包括氧化石墨烯的羧化、氧化石墨烯羧基的活化、聚乙二醇氨的修飾、螯合配基的修飾以及Ni²⁺的螯合。通過本發明得到的親和載體可以有效的解決其它親和載體如氧化石墨烯直接修飾Ni²⁺以及氧化石墨烯先修飾螯合配基再修飾Ni²⁺造成的固定化酶失活問題。通過本發明得到的固定化酶具有酶活高、酶活損失少等優勢。

技術領域

本發明涉及納米材料固定化酶，屬于納米復合材料領域，具體是一種氧化石墨烯親和固定化載體及其制備方法與應用。

背景技術

補充背景技術

酶是一類具有催化功能的生物分子，它在食品、醫藥以及工業生產中均有廣泛應用。酶的特點包括高效性、專一性、反應條件溫和。但是游離酶環境敏感性強，難以重復利用且不利于后續產物的分離，在工業化生產中存在諸多問題。為了解決這一難題，固定化酶技術應運而生。它是將水溶性酶通過選用不同的固定方法以及固定載體，變為不溶于水但仍具有催化活性的一種生物技術。固定化酶較游離酶有很多優點，如穩定性高、可進行工藝加工、可重復使用以及利于后續分離。固定化酶技術從20世紀60年代發展至今，已成為生物技術中最熱門的研究領域。

傳統的固定化酶方法包括吸附、共價結合、包埋以及交聯。但是，這些方法存在許多不足之處。吸附法容易造成酶的解吸附；共價結合容易破壞酶的結構；造成酶活回收率的大幅度損失；包埋容易造成底物的傳質受限；交聯反應較為激烈，酶活力損失較大。酶固定化的新趨勢是在“活化的”支持物和蛋白質表面上存在的特定基團之間產生不同的(生物)親和鍵，這種相互作用發生在生物體的幾乎所有重要生物過程中，如抗體和抗原、生物素和親和素、金屬離子和組氨酸標簽等。親和固定化提供了若干優點，包括：(1)與所有生物分子相似的選擇性和定向固定，因為“結合位點或支持物的特定基團”具有相同的連接，(2)酶結構中誘導的構象變化的最小化，和(3)用酶重新加載相同的活化表面并根據不同的需求重新使用載體的可能性。

通過特定的親和力相互作用固定酶有兩個主要要求：(1)生物相容性載體的選擇，該載體應具有必需的官能團(具有非常高的親和力)并且能夠特異性識別目標蛋白質外表面上存在的靶基團或者可以容易地官能化(2)酶表面上特定基團的可用性。因此，生物相容性載體的選擇至關重要。在大多數情況下，一些載體如無機氧化物、礦物質等不能滿足酶親和的要求，很少應用于親和固定化。相比之下，生物聚合物如殼聚糖以及瓊脂糖通常具有高蛋白質親和力以及生物相容性，可用作親和固定化的載體。隨著親和固定化酶的實際應用可能性的不斷增長，一些新型的載體如二氧化硅、磁性納米粒子、碳納米管、復合材料以及氧化石墨烯也廣泛用于親和固定化。

氧化石墨烯由于其獨特的優勢如高比表面積、良好的熱穩定性和化學穩定性、易于官能化和表面易調控等已被用作不同生物技術應用中酶固定的基質。Hermanová等人將脂肪酶固定在氧化石墨烯上，固定化酶具有高活性以及高穩定性；Su等人通過戊二醛將堿性蛋白酶共價結合到氧化石墨烯上，與游離酶相比，固定化蛋白酶的熱穩定性和可重復使用性得到了明顯改善；Zhou等人以多巴胺修飾氧化石墨烯用于葡萄糖氧化酶的固定化，實驗結果表明，固定化酶熱穩定性和pH穩定性均得到顯著提高。

然而氧化石墨烯作為固定化載體常常導致酶結構和功能的顯著損失，如辣根過氧化物酶(HRP)和酯酶與氧化石墨烯結合后損失約70％的活性，酶活性的顯著喪失可能與疏水性以及靜電性有關。這也使得以氧化石墨烯作為親和固定化載體的報道相對較少。聚乙二醇氨是一種人工合成的高分子材料，具有柔順、親水、良好的生物相容性以及對酶結構惰性等特點。在固定化過程中，其可通過其鏈結構的柔順性來延長酶蛋白與載體分子作用時間而減少其反沖力，維持酶的正確構象。載體經聚乙二醇氨修飾后，由原先剛性以及疏水性質變為柔順以及親水性質，減少酶與載體之間的碰撞作用，維持酶分子的正常構象，同時，聚乙二醇氨的修飾使酶與載體之間的距離較遠，從而使酶具有較高的自由度，有利于酶與底物之間的親和。綜上所述，以聚乙二醇氨功能化氧化石墨烯以用作親和固定化的載體是可行的方法。