[發明專利]一種同時檢測GA I和II型尿液異常代謝化合物的方法

在審

• 申請號: 201910387725.3
• 申請日: 2019-05-10
• 公開（公告）號: CN110095542A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 張萬巧;王艷;封志純;楊堯
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第七醫學中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙靜

本發明公開了一種對尿液進行前處理的方法以及基于該方法同時檢測GA I和II型尿液異常代謝化合物的方法。所述對尿液進行前處理的方法如下：在尿液中加入尿素酶，然后進行孵育；將尿素酶處理后的尿液樣本，加入內標十七烷酸及無水乙醇，充分混勻，離心，取上清液，用氮氣吹干，殘余物中加入BSTFA和TMCS，進行三甲基硅烷化衍生化處理。然后對處理后的尿液用GC?MS分析。利用代謝狀況無異常的兒童尿液代謝物檢測結果作為基準，通過各特征代謝化合物檢測值與基準值的比較進行GA I和II型診斷。運用該方法，無需標準品和先驗者樣本，只要儀器設備滿足要求，利用患者的尿液或干尿濾紙片均能準確實現GA的診斷及分型鑒別。

技術領域

本發明涉及一種同時檢測GA I和II型尿液異常代謝化合物的方法。

背景技術

戊二酸尿癥又稱為戊二酸血癥(Glutaric aciduria,GA)屬于遺傳代謝病(inherited metabolic diseases,IMDs)/先天性代謝異常(inborn errors ofmetabolism,IEMs)的范疇，因血液或尿液中出現以戊二酸(glutarate，GA)為代表的系列異常代謝物而得名，又分為戊二酸尿癥I型和II型。兩種類型的戊二酸尿癥有著不同的遺傳致病因素和臨床表現。戊二酸尿癥Ⅰ型(GA I)，是由位于19p13的GCDH基因突變引起戊二酰輔酶A脫氫酶活性完全或部分缺失，造成賴氨酸、羥賴氨酸和色氨酸代謝障礙以致組織和體液中戊二酸(glutarate,GA)、3-羥基戊二酸(3-hydroxyglutarate,3HG)、戊烯二酸(glutaconate)等蓄積的氨基酸類代謝異常。異常代謝物累積尤其在中樞神經系統(腦)內濃度最高，由興奮性損傷、能量代謝受損和氧化應激等機制導致神經毒性。患者常于出生后3至36個月時因非特異性疾病(發熱、感冒、饑餓等)誘發急性腦病危象，致嚴重神經功能后遺癥或死亡。戊二酸尿癥II型(GA II)也稱多種酰基輔酶A脫氫酶缺陷(MADD)，由編碼細胞線粒體的電子轉運黃素蛋白(ETF)α/β亞單位或電子轉運黃素蛋白脫氫酶(ETFDH)的基因(ETFA、ETFB、ETFDH)先天缺陷，導致多種脂肪酸、支鏈氨基酸等代謝障礙，伴隨體液(血/尿)中大量戊二酸(GA)、乙基丙二酸(EMA)、異戊酰甘氨酸(IVG)、雙羧酸等蓄積，是一種干擾機體分解蛋白質和脂肪產生能量的疾病，屬于脂肪酸類代謝異常。GAII臨床表現復雜多樣，從出生后數小時到成年人均可發病。新生兒起病型可伴有先天發育畸形，如多囊腎、腎髓質發育不良、肺臟發育不全、先天性搖椅形平足和面部畸形；表現為出生后數日即出現呼吸困難、代謝性酸中毒、低血糖、高血氨、肌張力低下以及特殊的汗腳氣味，病情危重，多于早期死亡。遲發型個體差異大，間歇性發作，多于感染、腹瀉、饑餓和藥物等應激狀態下起病，以心肌、骨骼肌和肝臟受累為主，伴或不伴低血糖、代謝性酸中毒和高氨血癥。GA I和II型均屬于罕見的常染色體隱性遺傳疾病，臨床癥狀非特異，個體差異明顯；特別是晚發型患者起病隱匿，診斷比較困難。明確診斷需應用氣相色譜-質譜(GC-MS)和串聯質譜(MS/MS)分析技術對尿有機酸，血脂肪酸、酰基肉堿成分及含量進行檢測。

我國的遺傳代謝病質譜篩查起步較晚，基礎薄弱。雖然近年來已有多個中心城市的實驗室開展基于串聯質譜(MS/MS)的血篩查和基于GC-MS的尿篩查工作，但仍存在儀器設備、疾病分析軟件依賴進口，缺乏符合中國人種群特異性的IMD診斷標準等不足。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明的一個目的是提供一種對尿液進行前處理的方法。使得處理后的尿液通過GC-MS分析能同時對尿液中的疾病標志物戊二酸(GA)、乙基丙二酸(EMA)、3羥基戊二酸(3HG)、2羥基戊二酸(2HG)、己二酸(adipate)、辛二酸(suberate)、癸二酸(sebacate)以及內源性肌酐(Cr)進行定性和定量分析。

本發明所提供的對尿液樣本進行前處理的方法，包括下述步驟：

(1)尿素酶預處理：在尿液樣本中加入尿素酶，然后進行孵育；