[發明專利]一種間充質干細胞的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201910386360.2
• 申請日: 2019-05-09
• 公開（公告）號: CN110229786A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 聶瑛潔;張湘燕;陳輝;胡榮貴;余福勛;羅振華;葉賢偉;查艷;許永杰
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P37/02
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 潘衛鋒

一種間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：(1)從綠色熒光蛋白轉基因的小鼠的股骨和脛骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在無菌條件下進行的；(2)通過Ficoll?Paque密度梯度離心法選擇骨髓單核細胞；(3)在37℃下和5％CO₂的75?cm²燒瓶中，在補充有體積分數為20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的改良的EAG培養基(MEM?α)中進行培養；(4)每4?5天更換一次含有非貼壁細胞的培養基；(5)在達到90％匯合后，通過胰蛋白酶消化收獲貼壁細胞；在這種條件下，Sca?1陽性細胞超過96.67％。本發明大幅提高了細胞增殖速度，為細胞提供更充足的營養，促進蛋白質的合成，可以有效地提高和增強干細胞治療系統性紅斑狼瘡的療效。

技術領域

本發明屬于生命科學的技術領域，具體地，涉及用于治療紅斑狼 瘡的一種間充質干細胞的制備方法及其應用。

背景技術

系統性紅斑狼瘡(簡稱SLE)是一種常見的免疫性疾病。病因尚不 明確，其特點為整個免疫系統功能紊亂，細胞凋亡異常，淋巴細胞功 能異常，其血清具有以抗核抗體為代表的多種自身抗體，造成全身多 系統器官的慢性損害。傳統激素免疫抑制劑的治療方式副作用大，病 人需終身服藥。系統性紅斑狼瘡是一種累及多系統多器官的自身免疫 病，患者體內免疫系統功能紊亂，T、B淋巴細胞異常活化，產生多 種自身抗體和免疫復合物，導致患者皮膚、關節、腎臟等全身多個器 官及系統受到損害。SLE好發于青年女性，男女比例為1：9，在我 國成年女性中發病率為0.1％，高于西方國家的0.05％，且隨著社會 經濟的發展及生活壓力的增加，SLE的發病率日益上升，由于該病病 程長且反復發作，給患者的心理和生理帶來了極大的影響。

SLE常用的治療方法主要是通過服用糖皮質激素或免疫抑制劑 等藥物，以此來緩解因免疫系統攻擊正常組織所造成的炎癥反應和抑 制免疫系統的作用。雖然糖皮質激素與免疫抑制劑被用于治療系統性 紅斑狼瘡使患者的預后有了明顯改善，但是，SLE的治療現狀仍不容 樂觀：①目前仍然有約10％的患者在發病5年內死亡；②由于疾病 的進展及一些治療帶來的副作用，如出現感染、骨髓抑制、骨質疏松、 高血壓、糖尿病等，尤其是細胞毒藥物及糖皮質激素的應用，SLE患 者的平均壽命明顯短于正常人群；③常規的治療方法只能減緩病情的 發展速度，非根治疾病。因此，尋找一些高效、副作用少的新治方已 迫在眉睫。

自1996年開始用自體造血干細胞(HSC)移殖治療SLE以來，在 重癥難治性SLE中取得了較好的療效，但存在易復發的問題，而異 基因HSC移殖治療SLE雖能使部分患者病情長期緩解，但供體來源 不足，病死率高達30％～50％，且治療費用高。骨髓中除了HSC外 還存在一種形態上類似成纖維細胞的間充質干細胞(MSC)，MSC具有 多向分化潛能、免疫原性低與增殖速度快等特點。MSC不僅具有支 持造血的功能，還具有免疫調節及誘導免疫耐受的功能，研究表明 MSC發揮免疫調節及誘導免疫耐受的機理主要是：抑制T細胞增殖， 使產生白細胞介素4(IL-4)的細胞數減少，產生干擾素γ(IFN-γ)的細 胞數增加，調節Th1/Th2的平衡。

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重 要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC具有干細胞的共 性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。在特定的機體外分化環境 下，能夠誘導分化為神經、心臟、肝臟、骨、軟骨、肌腱、脂肪、上 皮等多種組織細胞。

MSC由于具有自我更新和多向分化的潛能，成為近年來研究的 熱點。大量研究證實，MSC可以從骨髓中分離得到，也存在于其他 不同組織和臟器中，如脂肪組織、臍帶血、臍帶、胎盤等。骨髓間充 質干細胞(BMSCs)是骨髓基質干細胞，對骨髓中的造血干細胞(HSC)不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子(如IL-6，IL-11，LIF， M-CSF及SCF等)來支持造血。