[發(fā)明專利]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910386360.2
• 申請日: 2019-05-09
• 公開（公告）號: CN110229786A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聶瑛潔;張湘燕;陳輝;胡榮貴;余福勛;羅振華;葉賢偉;查艷;許永杰
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P37/02
• 代理公司: 北京棧橋知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11670
• 代理人: 潘衛(wèi)鋒

1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因的小鼠的股骨和脛骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在無菌條件下進行的；

(2)通過Ficoll-Paque密度梯度離心法選擇骨髓單核細(xì)胞；

(3)在37℃下和5％CO₂的75-cm²燒瓶中，在補充有體積分?jǐn)?shù)為20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的改良的EAG培養(yǎng)基(MEM-α)中進行培養(yǎng)；

(4)每4-5天更換一次含有非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基；

(5)在達(dá)到90％匯合后，通過胰蛋白酶消化收獲貼壁細(xì)胞；在這種條件下，Sca-1陽性細(xì)胞超過96.67％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，進行密度梯度離心法時首先將置于離心管中的骨髓抽吸物用與所述骨髓抽吸物等體積的磷酸緩沖鹽溶液進行3遍洗滌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述離心管是采用SepMate^TM離心管，安裝有插件；離心是以2800-3200r/min的轉(zhuǎn)速進行離心操作30-40min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述Ficoll-Paque為Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的產(chǎn)品；所述鏈霉素為Sigma Chemical Co.的產(chǎn)品；進行胰蛋白酶消化時采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％胰蛋白酶-EDTA，為Sigma Chemical Co.的產(chǎn)品。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)和(3)之間好包括分選純化的步驟，采用CD14^-和CD105⁺雙標(biāo)分選純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，EAG培養(yǎng)基的pH值為7.2-7.4。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟(5)中，進行胰蛋白酶消化的時間為3.5-4.5分鐘min。

8.一種間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法制備，所述間充質(zhì)干細(xì)胞在疾病的早期輸注到染病個體中，用藥量為2劑量，每1劑量為1×10⁶/染病個體/輸注。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，疾病的早期是指染病開始的8周時間。