[發明專利]基于酶-無定形金屬有機骨架復合物的活細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法

有效

• 申請號: 201910384187.2
• 申請日: 2019-05-09
• 公開（公告）號: CN111912822B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 戈鈞;張原宇;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

本發明公開了一種基于新型酶?無定形金屬有機骨架復合物的活細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法。本發明方法利用新型酶?定形金屬有機骨架復合物以及熒光探針進行活細胞檢測，不僅能有效檢測活細胞胞內葡萄糖濃度，并且能保持檢測后細胞的狀態良好。通過本方法可以同時在單細胞和細胞群體兩個尺度上有效檢測活細胞內的葡萄糖濃度，能夠有效區分癌細胞和非癌細胞，在研究細胞的葡萄糖代謝，以及癌癥的診斷治療上具有重要意義。與現有胞內葡萄糖檢測方法相比，本發明方法具有操作方便，設備簡單，重復性良好，對細胞的損傷較小等多種優勢。

技術領域

本發明涉及一種活細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法，具體涉及一種基于新型酶-無定形金屬有機骨架復合物的活細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法。

背景技術

細胞作為生物形態和機構的基本單元，檢測胞內葡萄糖濃度對了解細胞的生長、代謝，乃至于疾病的診斷與治療，都具有重要的意義。不同的組織細胞具有差異性，不同種類細胞的胞內葡萄糖濃度不盡相同，甚至同種細胞間也會有一定差異。理論和實驗證據均表明惡性腫瘤細胞的胞內葡萄糖濃度則會顯著增加。傳統檢測細胞內葡萄糖濃度的手段大多需要將細胞破碎后，采用相應的儀器如高效液相色譜等進行檢測。因此傳統檢測手段不僅不能實現活細胞檢測，檢測結果也基于大量細胞的統計平均，在疾病比如癌癥的檢測中，往往會遮蓋住癌癥早期少量癌細胞產生的異常信號，造成漏診，誤診。因此傳統檢測手段具有低靈敏度，區分度，且對細胞具有巨大的破壞性。而可以檢測單細胞胞內葡萄糖濃度的活細胞檢測則為解決上述難題提供了有效的手段。

美國專利(US8173863B2)公開了一種基于熒光共振能量轉移的胞內葡萄糖濃度檢測方法。該方法公開了一種可以由細胞表達的葡萄糖熒光指示物，比如 FLIPglu600μΔ11，包括葡萄糖結合蛋白，與之共價結合的供體熒光蛋白以及受體熒光蛋白。當葡萄糖與葡萄糖結合蛋白接觸后，將使供體熒光蛋白與受體熒光蛋白間的熒光共振能量轉移強度發生變化，從而可以作為葡萄糖濃度的指示物。

除上述提到的專利以外，也有文獻提出利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化形成葡萄糖酸引起溶液pH變化，從而引起胞質內電導率的變化，通過掃描離子電導顯微鏡檢測胞質內阻抗的變化即可以測量胞內葡萄糖的濃度。以此為原理，Pourmand等人將葡萄糖氧化酶固定在納米檢測探頭上，設計了檢測單細胞內葡萄糖的“葡萄糖納米傳感器”(NaderPourmand et al.,Nano Lett.,2016,16,1194-1200)。

然而，專利文件US20090083196所公開的方法中，需要將相應蛋白的基因通過基因工程手段導入細胞，因而需要進行較為復雜的操作，此外，該方法受到類型的影響較大，有部分細胞無法表達葡萄糖指示物，這也限制了該方法的進一步應用。Pourmand 等人所提出的納米探針檢測方法需要制備較為復雜的納米探針，檢測中所必須的掃描離子電導顯微鏡也造成該實驗復雜程度上升。此外該方法檢測過程中對細胞的穿刺也會對細胞造成一定的損傷。因而提出一種簡單可靠，對細胞的破壞性較小，并且能同時在細胞群體和單細胞尺度上檢測細胞內葡萄糖濃度的方法頗具挑戰和意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種活細胞內葡萄糖濃度的檢測方法，本發明方法基于一種新型酶-無定形金屬有機骨架復合物，可以同時從細胞群體以及單細胞尺度檢測活細胞胞內葡萄糖濃度。

本發明所提供的細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法，包括如下步驟：

(1)向至少四種(優選四種至六種)離體的細胞中分別加入下述1)或2)，然后在活細胞成像系統上測定激發波長和發射波長分別為488nm和525nm處的熒光強度隨時間的變化，所述熒光強度的最大值的差值F₁即為測定的細胞的熒光強度；

1)體積相同的2’,7’-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液；

2)體積相同的磷酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液和酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液；