[發明專利]基于酶-無定形金屬有機骨架復合物的活細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法

有效

• 申請號: 201910384187.2
• 申請日: 2019-05-09
• 公開（公告）號: CN111912822B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 戈鈞;張原宇;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

1.一種非治療和/或診斷目的的細胞胞內葡萄糖濃度的檢測方法，包括如下步驟：

（1）向至少四種離體的細胞中分別加入下述1）或2），然后在活細胞成像系統上測定激發波長和發射波長分別為488nm和525nm處的熒光強度隨時間的變化，所述熒光強度的最大值的差值F₁即為測定的細胞的熒光強度；

1）體積相同的2’,7’-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液；

所述2’,7’-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯的濃度為1~10μM；

2）體積相同的磷酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液和酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液；

所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液中所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的質量-體積濃度為10~20μg/mL；

所述熒光強度的最大值的差值F₁指的是加入1）后的體系與加入2）后的體系所測定的熒光強度的最大值的差值；

所述2’,7’-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯的溶液和所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液均由所述磷酸緩沖液或所述磷酸鹽緩沖液配制；

所述酶-無定形金屬有機骨架復合物呈平均粒徑為100~200nm的顆粒狀；

于pH為中性的條件下，所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的表面電荷為18~25mV；

所述酶-無定形金屬有機骨架復合物由包括如下步驟的方法制備：

將葡萄糖氧化酶、鋅離子和2-甲基-1H-咪唑在溶劑中進行反應即得；

制備所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的方法具體如下：

將可溶性鋅鹽的溶液加入至所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中，產生沉淀后加入所述葡萄糖氧化酶的溶液，經攪拌后離心分離即可；

所述可溶性鋅鹽的溶液中所述鋅離子的濃度為15~25mM，所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中所述2-甲基-1H-咪唑的濃度為70~90mM，所述葡萄糖氧化酶的溶液中所述葡萄糖氧化酶的質量體積濃度為0.5~1mg/mL；

所述鋅離子來自于所述可溶性鋅鹽；

所述可溶性鋅鹽的溶液、所述2-甲基-1H-咪唑的溶液與所述葡萄糖氧化酶的溶液均由所述溶劑配制；

所述活細胞成像系統為激光共聚焦高內涵活細胞成像系統；

（2）將至少四種離體的所述細胞分別經胰蛋白酶消化后進行計數，然后進行細胞破碎，取上清液并設置濃度梯度；取葡萄糖標準溶液，并設置濃度梯度；分別向所述上清液和所述葡萄糖標準溶液中加入含有葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶和ABTS的溶液，反應結束后測定415nm處的吸光度變化，得到含有每種細胞的所述上清液和所述葡萄糖標準溶液的吸光度-樣品體積曲線，經線性擬合得兩條直線，由所述直線的斜率即得到所述細胞內的葡萄糖濃度，由至少四種所述細胞的熒光強度和所述細胞內的葡萄糖濃度關系，得到熒光強度和細胞內葡萄糖濃度之間的標準曲線；

所述葡萄糖標準溶液的濃度為0~100μM，但不為零；

（3）按照步驟（1）的方法測定待測細胞群或單細胞的熒光強度，根據步驟（2）得到的所述標準曲線，即得到所述細胞群或所述單細胞內的葡萄糖濃度。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述磷酸緩沖液或所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.2~7.5，濃度為5~20mM。

3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：步驟（1）中，為了使所述酶-無定形金屬有機骨架復合物充分分散，所述方法還包括對所述酶-無定形金屬有機骨架復合物的濁液進行超聲分散的步驟。

4.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：步驟（2）中，采用所述磷酸鹽緩沖液或所述磷酸緩沖液洗滌經所述胰蛋白酶消化后的細胞；

采用所述磷酸鹽緩沖液或所述磷酸緩沖液重懸后進行細胞計數。