[發(fā)明專利]利用ccdB致死基因快速構建重組質粒的方法

在審

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• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110218733A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 蘇丹;江華;盧德仁
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及利用ccdB致死基因快速構建重組質粒的方法。本發(fā)明使用PCR和菌體內同源重組的機制相結合，擺脫了載體構建中對DNA酶切和連接的依賴；引入ccdB致死基因，簡化了陽性克隆的篩選。本發(fā)明可用于高通量的載體構建，具有省時、省力、低成本的優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及利用ccdB致死基因快速構建重組質粒的方法。

背景技術

質粒是現(xiàn)代生物學研究的基本工具，已經(jīng)應用到生命科學研究與醫(yī)療健康發(fā)展的各個方面，如文庫建立、蛋白表達、基因治療、基因編輯和DNA疫苗等方方面面。分子克隆技術是將擴增的目的DNA片段插入到目的質粒載體的過程，是現(xiàn)代生物醫(yī)學研究的核心技術之一，質粒構建幾乎成為所有生物醫(yī)學基礎研究的首要工作。隨著第三代基因測序技術的推廣，大量數(shù)字化基因信息需要轉化為生物醫(yī)學基礎研究所必須的各種重組質粒。快速建立單個基因的多用途載體庫，成為了很多研究者的迫切需求。

傳統(tǒng)分子克隆技術依賴多種生物工程酶，且需要體外連接反應，并存在菌落驗證假陽性的問題，其工作流程繁瑣、復雜、費時、費力，已經(jīng)不適應現(xiàn)代生物醫(yī)學基礎研究的需求。

借助同源重組的方法能夠避免傳統(tǒng)分子克隆技術所依賴的核酸內切酶和連接酶。其基本原理是，通過帶有同源序列的2對引物分別PCR擴增質粒載體和目的基因，分別帶有線性質粒載體和線性目的基因的PCR產(chǎn)物(其中線性質粒載體和線性目的基因帶有同源序列，該同源序列是由PCR引物引入的)，再將前述2種PCR產(chǎn)物同時轉入到感受態(tài)細胞內，使其中的線性質粒載體與線性目的基因發(fā)生同源重組，再通過抗生素篩選(質粒載體中帶有該抗生素的抗性基因)，即可得到陽性重組載體。但是，該方法具有假陽性的缺點：PCR產(chǎn)物中仍然帶有一部分未擴增的環(huán)狀空載體，環(huán)狀空載體與線性目的基因不會發(fā)生重組，帶有該環(huán)狀空載體的感受態(tài)細胞仍然可以在抗生素篩選下形成克隆，因而產(chǎn)生了假陽性。

發(fā)明內容

為了杜絕重組質粒構建的過程中，空載體導致的假陽性，本發(fā)明提供了以下技術方案：

利用ccdB致死基因快速構建重組質粒的方法，包括以下步驟：

a、PCR擴增ccdB基因表達盒子、表達載體和目的基因，得到含線性ccdB基因表達盒子的PCR產(chǎn)物、含線性表達載體的PCR產(chǎn)物和含線性目的基因的PCR產(chǎn)物；所用到的引物為：(1)ccdB基因表達盒子的擴增引物ccdB-HF和ccdB-HR；(2)載體擴增引物HF和HR；(3)擴增目的基因的引物gene-HF和gene-HR；

b、將步驟a得到的含線性ccdB基因表達盒子的PCR產(chǎn)物與含線性表達載體的PCR產(chǎn)物混合后轉入耐受ccdB蛋白的感受態(tài)細胞，在含有抗生素A和抗生素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，線性ccdB基因表達盒子與線性表達載體發(fā)生同源重組，得到帶ccdB基因表達盒子的環(huán)狀載體；抗生素A和抗生素B不同；

c、使用載體擴增引物擴增步驟b得到的帶ccdB基因表達盒子的環(huán)狀載體，得到含有刪除ccdB基因表達盒子的線性載體的PCR產(chǎn)物；

d、將步驟a得到的含線性目的基因的PCR產(chǎn)物與步驟c得到的含有刪除ccdB基因表達盒子的線性載體的PCR產(chǎn)物混合后轉入不耐受ccdB蛋白的感受態(tài)細胞，在含有抗生素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，線性目的基因與刪除ccdB基因表達盒子的線性載體同源重組，得帶有目的基因的環(huán)狀載體；

步驟a所述的ccdB基因表達盒子是含有啟動子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；

步驟a中ccdB基因表達盒子的擴增引物序列以及擴增目的基因的引物序列均包括2個片段：(I)能夠擴增ccdB基因表達盒子或目的基因的片段，(II)能夠與表達載體同源重組的片段；片段(I)位于片段(II)的3’側；

所述同源重組的片段是載體擴增引物與表達載體配對的部分或全部片段。