[發(fā)明專利]利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910382063.0
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110218733A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 蘇丹;江華;盧德仁
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、PCR擴增ccdB基因表達盒子、表達載體和目的基因，得到含線性ccdB基因表達盒子的PCR產(chǎn)物、含線性表達載體的PCR產(chǎn)物和含線性目的基因的PCR產(chǎn)物；所用到的引物為：(1)ccdB基因表達盒子的擴增引物ccdB-HF和ccdB-HR；(2)載體擴增引物HF和HR；(3)擴增目的基因的引物gene-HF和gene-HR；

b、將步驟a得到的含線性ccdB基因表達盒子的PCR產(chǎn)物與含線性表達載體的PCR產(chǎn)物混合后轉入耐受ccdB蛋白的感受態(tài)細胞，在含有抗生素A和抗生素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，線性ccdB基因表達盒子與線性表達載體發(fā)生同源重組，得到帶ccdB基因表達盒子的環(huán)狀載體；抗生素A和抗生素B不同；

c、使用載體擴增引物擴增步驟b得到的帶ccdB基因表達盒子的環(huán)狀載體，得到含有刪除ccdB基因表達盒子的線性載體的PCR產(chǎn)物；

d、將步驟a得到的含線性目的基因的PCR產(chǎn)物與步驟c得到的含有刪除ccdB基因表達盒子的線性載體的PCR產(chǎn)物混合后轉入不耐受ccdB蛋白的感受態(tài)細胞，在含有抗生素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，線性目的基因與刪除ccdB基因表達盒子的線性載體同源重組，得帶有目的基因的環(huán)狀載體；

步驟a所述的ccdB基因表達盒子是含有啟動子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；

步驟a中ccdB基因表達盒子的擴增引物序列以及擴增目的基因的引物序列均包括2個片段：(I)能夠擴增ccdB基因表達盒子或目的基因的片段，(II)能夠與表達載體同源重組的片段；片段(I)位于片段(II)的3’側；

所述同源重組的片段是載體擴增引物與表達載體配對的部分或全部片段。

2.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：所述片段(II)的長度為18nt。

3.根據(jù)權利要求3所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：所述同源重組的片段是載體擴增引物與表達載體配對的全部片段。

4.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟b中所述感受態(tài)細胞為大腸桿菌DB3.1的感受態(tài)細胞。

5.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：所述抗生素A是氯霉素。

6.根據(jù)權利要求5所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：所述ccdB基因表達盒子DNA序列如SEQ ID NO：14所示。

7.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟a所述的表達載體的數(shù)量為2個以上，表達載體攜帶一段36bp以上的固定序列，該固定序列能被引物HF和HR匹配擴增出載體的全長。

8.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟d所述感受態(tài)細胞為大腸桿菌菌株DH5α的感受態(tài)細胞。

9.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟d中，“步驟a得到的含線性目的基因的PCR產(chǎn)物”與“步驟c得到的含有刪除ccdB基因表達盒子的線性載體的PCR產(chǎn)物”的摩爾比為2∶1。

10.根據(jù)權利要求1所述的利用ccdB致死基因快速構建重組質(zhì)粒的方法，其特征在于：還包括步驟e：挑選單克隆菌落進行菌液PCR驗證，提取質(zhì)粒并測序鑒定，得到含有相同基因的不同功能用途的重組表達質(zhì)粒。