[發(fā)明專利]提高嵌合抗原受體T細(xì)胞療效和作用持久性的細(xì)胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910380701.5
• 申請(qǐng)日: 2019-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN110157680A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃河;張浩;徐玉林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1.一種提高嵌合抗原受體T細(xì)胞療效和作用持久性的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞制備：取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備外周血單個(gè)核細(xì)胞；

(2)CD3(+)T細(xì)胞富集及T細(xì)胞激活：

使用anti-CD3/CD28磁珠，與外周血單個(gè)核細(xì)胞充分混勻并結(jié)合于CD3(+)T細(xì)胞后，予磁力架富集CD3(+)T細(xì)胞，并同時(shí)利用結(jié)合在磁珠表面的anti-CD3/CD28抗體激活CD3(+)T細(xì)胞；

(3)攜帶靶向CD19的CAR慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞：將已制備好的攜帶靶向CD19的CAR的慢病毒按照MOI＝10轉(zhuǎn)染anti-CD3/CD28磁珠活化的CD3(+)T細(xì)胞；

(4)添加絡(luò)氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼擴(kuò)大培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞

取培養(yǎng)3-5天的CAR-T細(xì)胞，流式檢測(cè)CAR分子的表達(dá)，確認(rèn)CAR-T細(xì)胞制備成功后，將CAR-T細(xì)胞分2組分別連續(xù)培養(yǎng)9天；

(5)CAR-T細(xì)胞亞群檢測(cè)：培養(yǎng)第9天取樣本標(biāo)記熒光抗體CD45RO、CD62L，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR-T細(xì)胞亞群；

(6)CAR-T細(xì)胞耗竭相關(guān)表面分子的檢測(cè)

培養(yǎng)第9天取樣本標(biāo)記熒光抗體PD1、TIM3、LAG3，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR-T細(xì)胞耗竭相關(guān)表面分子；

(7)評(píng)估經(jīng)達(dá)沙替尼處理的CAR-T細(xì)胞療效及持久性

分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用DMSO處理的CAR-T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組用達(dá)沙替尼30nM培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞，通過成像儀比較兩組腫瘤負(fù)荷差異，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞比例，繪制生存曲線。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高嵌合抗原受體T細(xì)胞療效和作用持久性的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)所述培養(yǎng)是分別使用添加與不添加絡(luò)氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高嵌合抗原受體T細(xì)胞療效和作用持久性的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)所述分2組為實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組為達(dá)沙替尼30nmol/L組，對(duì)照組為等體積DMSO組。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高嵌合抗原受體T細(xì)胞療效和作用持久性的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加達(dá)沙替尼的培養(yǎng)液為RPMI1640+10％FBS+IL-2 200U/ml+達(dá)沙替尼30nM，所述不添加達(dá)沙替尼的培養(yǎng)液為RPMI1640+10％FBS+IL-2 200U/ml+等體積DMSO。