[發明專利]一種多重PCR方法

有效

• 申請號: 201910380299.0
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110144387B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 漆小泉;張英春;馮來寶;池旭
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 魏少偉

本發明公開了一種多重PCR方法。本發明公開的多重PCR方法包括：利用滿足如下條件的成套引物進行PCR擴增：每個引物對的因素J小于50％，且9個因素中至多一個因素不在標準范圍內；9個因素為因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；標準范圍如下：35％≤因素A≤60％；68℃≤因素B≤79℃；30％≤因素C≤70％；30％≤因素D≤70％；15kcal/mol≤因素E的絕對值≤70kcal/mol；因素F的絕對值＜100kcal/mol；因素G的絕對值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤因素H的絕對值≤10kcal/mol；因素I＜100℃。實驗證明，本發明的方法可用于多重PCR。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，一種多重PCR方法。

背景技術

PCR(聚合酶鏈式反應)是在基因組上設計特異性的引物序列對目標片段進行特異性的擴增。1985年，美國Karray等學者首創了PCR技術，并由美國Cetus公司開發研制。隨著PCR技術的不斷發展，在常規PCR技術的基礎上又衍生出了許多技術，如多重PCR技術、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quatitative PCR,FQ-PCR)技術、單分子PCR技術和微滴PCR技術。

高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(NextGeneration Sequencing,NGS)是2004年后新興的一系列測序技術，能一次平行對大量(幾十萬到幾百萬)DNA分子進行序列測定。已經在基因組從頭測序、基因組重測序、轉錄組測序、表觀遺傳學、單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)開發等等方面，將使基因組學成為研究生物學問題的常規方法，成為人們研究分子生物學、分子遺傳學等等的有力工具。

在多種新一代測序技術中，Illumina公司開發的基因組分析儀(GenomeAnalyzer,GA)是由隸屬英國劍橋大學的Solexa公司建立，是基于邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)原理，由于具有成本相對較低、通量大、前處理較為簡單等等優勢，是目前使用最廣泛的二代測序技術平臺。Illumina不斷升級GA，特別是HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq系列測序儀研發完成。

Illumina GA和HiSeq測序平臺都需要嚴格的樣品前處理過程，并且不具有選擇性，因此，如果對基因組(或轉錄組)中某一特定的區域感興趣，則需要在Illumina樣品前處理之前對目標區域進行選擇性的富集。目前通用的選擇性富集的方法包括PCR、MIP(Molecular Inversion Probe)和DNA芯片(Microarray)。其中，MIP和DNA芯片技術較為復雜，適合大量群體中目標片段的富集，成本費用高，需要的起始基因組DNA的用量大。并且這些方法都需要建立質量較高的樣品文庫，從而增加了實驗的成本費用。PCR技術是一種具有良好的選擇性并且技術要求較低的方法，雖然擴增中會產生核苷酸的突變會在Illumina的樣品前處理中放大，造成過多的假陽性結果；但是隨著二代測序技術的不斷發展(例如Illumina GA在2006-2012年間更新了6代，Illumina Hiseq在2010-2015年之間更新了7代)，測序的成本費用在不斷的降低，測序長度在不斷的增加，那么增加測序深度足以能解決由于PCR選擇性富集的缺陷。

發明內容

本發明所解決的技術問題是如何進行多重PCR擴增。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種多重PCR方法，所述方法包括：利用成套引物進行PCR擴增，實現多重PCR；所述成套引物滿足如下a1)、a2)和a3)：

a1)所述成套引物由n個引物對組成，n為大于等于2的自然數；

a2)所述成套引物中的每個引物對的因素J小于50％，所述因素J為引物對的反向引物與所述成套引物的其它引物形成引物二聚體的個數占所述成套引物中引物個數的百分比；