[發明專利]一種多重PCR方法

有效

• 申請號: 201910380299.0
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110144387B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 漆小泉;張英春;馮來寶;池旭
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 魏少偉

1.多重PCR方法，包括：利用成套引物進行PCR擴增，實現多重PCR；所述成套引物滿足如下a1）、a2）和a3）：

a1）所述成套引物由n個引物對組成，n為大于等于2的自然數，15≤n≤20；

a2）所述成套引物中的每個引物對的因素J小于50%，所述因素J為引物對的反向引物與所述成套引物的其它引物形成引物二聚體的個數占所述成套引物中引物個數的百分比；

a3）所述成套引物中的每個引物對的9個因素中的A、B、C、D、E、F、G、H均在標準范圍內；所述9個因素為因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；

所述因素A為引物對的反向引物的GC含量；

所述因素B為引物對的反向引物的TM值，

所述因素C為目標片段的GC含量；

所述因素D為從目標片段上游400bp處至該目標片段下游400bp處間的DNA片段的GC含量；

所述因素E為目標片段的結構自由能；

所述因素F為目標片段及目標片段下游150bp的連續DNA片段的結構自由能；

所述因素G為目標片段及目標片段上游150bp的連續DNA片段的結構自由能；

所述因素H為引物對的正向引物3’末端5個核苷酸的結構自由能；

所述因素I為引物對的反向引物與所述成套引物的其它引物中部連續大于等于5個核苷酸所形成的多個雙鏈DNA的TM值總和；

所述9個因素的標準范圍如下：

35%≤所述因素A≤60%；

68℃≤所述因素B≤79℃；

30%≤所述因素C≤70%；

30%≤所述因素D≤70%；

15 kcal/mol≤所述因素E的絕對值≤70 kcal/mol；

所述因素F的絕對值＜100 kcal/mol；

所述因素G的絕對值＜100 kcal/mol；

4 kcal/mol≤所述因素H的絕對值≤10 kcal/mol；

所述因素I＜100℃；

所述PCR擴增所用DNA聚合酶為Q5 High-Fidelity 2X Master Mix中的DNA聚合酶；

所述成套引物的每條引物在所述PCR擴增的體系中的濃度為0.088 pmol/μL；

所述PCR擴增的循環數為20。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR擴增的退火溫度為e1）或e2）：

e1）58-65 ℃；

e2）60 ℃。

3.多重PCR引物的制備方法，包括：制備滿足權利要求1中所述a1）、所述a2）和所述a3）的成套引物，得到用于多重PCR的引物。

4.權利要求1-3中任一所述方法在對生物基因組進行多重PCR擴增中的應用。

5.權利要求1-3中任一所述方法在構建DNA測序文庫中的應用。

6.權利要求1-3中任一所述方法在DNA測序中的應用。

7.權利要求1-3中任一所述方法在篩選基因組突變位點中的應用。

8.權利要求1-3中任一所述方法在篩選生物突變體中的應用。