[發(fā)明專(zhuān)利]用于糖多孢菌的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910379905.7
• 申請(qǐng)日: 2019-05-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111909946B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶美鳳;白露露;王業(yè)民;鄧子新
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/62;C12R1/01
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

1.一種用于糖多孢菌的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒依次包括如下元件：mini-Tn5，啟動(dòng)子Promoter1、Promoter2、Promoter3、Promoter4、Promoter5或Promoter6，SEQ ID NO.13所示的轉(zhuǎn)座酶基因tnp(5)，氨芐青霉素抗性基因bla，SEQ ID NO.29所示的接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT；所述mini-Tn5 依次包括SEQ ID NO.1所示的轉(zhuǎn)座子末端序列ME、SEQ ID NO.2所示的特異性DNA重組位點(diǎn)attBφC31、SEQ ID NO.3所示的特異性DNA重組位點(diǎn)attBφBT1、SEQ IDNO.4所示的lox71位點(diǎn)、SEQ ID NO.5所示的復(fù)制子ori-pUC、SEQ ID NO.6所示的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV、SEQ ID NO.7所示的lox66位點(diǎn)、SEQ ID NO.8所示的特異性DNA重組位點(diǎn)attBΦRv1、SEQ ID NO.9所示的特異性DNA重組位點(diǎn)attBΦJoe、SEQ ID NO.10所示的特異性DNA重組位點(diǎn)attBΦTp901-1和SEQ ID NO.11所示的轉(zhuǎn)座子末端序列ME。

2.一種如權(quán)利要求1所述的用于糖多孢菌的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)座誘變糖多孢菌中的用途，所述糖多孢菌為刺糖多孢菌、紅色糖多孢菌。

3.一種如權(quán)利要求1所述的用于糖多孢菌的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1、基因合成依次包含轉(zhuǎn)座子末端序列ME、特異性DNA重組位點(diǎn)attBφC31、 attBφBT1、lox71位點(diǎn)的DNA片段1，EcoRI-PciI酶切后連接至質(zhì)粒pHL734，得到質(zhì)粒pHHB735；所述轉(zhuǎn)座子末端序列ME序列如SEQ ID NO.1所示，attBφC31位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.2所示，attBφBT1位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.3所示，lox71位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.4所示；

所述質(zhì)粒pHL734為文獻(xiàn)“Zhong Xu , Yemin Wang ,Keith F .Chater ,Hong-Yu Ou ,H .Howard Xu ,Zixin Deng ,Meifeng Tao； Large-Scale Transposition Mutagenesisof Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes InfluencingAntibiotic Biosynthesis .Appl Environ Microbiol . 2017Mar 15；83(6):e02889-16.”中公開(kāi)的質(zhì)粒pHL734；

S2、基因合成依次包含阿泊拉霉素抗性基因3’端部分序列、lox66位點(diǎn)、特異性DNA重組位點(diǎn)attBΦRv1、attBΦJoe、attBΦTp901-1、轉(zhuǎn)座子末端序列ME、啟動(dòng)子KasOP*、轉(zhuǎn)座酶基因5’端部分序列的DNA片段2，BstEII-AsiSI酶切后連接至質(zhì)粒pHHB735，得到質(zhì)粒pHHB736；阿泊拉霉素抗性基因3’端部分序列如SEQ ID NO.30所示，lox66位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.7所示，attBΦRv1位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.8所示，attBΦJoe位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.9所示，attBΦTp901-1位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.10所示，轉(zhuǎn)座子末端序列ME序列如SEQ ID NO.11所示，啟動(dòng)子KasOP*序列如SEQ ID NO.12所示，轉(zhuǎn)座酶基因5’端部分序列如SEQ ID NO.31所示；

S3、分別基因合成包含啟動(dòng)子Promoter1、Promoter2、Promoter3、Promoter4、Promoter5或Promoter6 DNA序列的片段SEG-pro1、SEG-pro2、SEG-pro3、SEG-pro4、SEG-pro5或SEG-pro6，NheI-BamHI酶切后連接至質(zhì)粒pHHB736，得到質(zhì)粒pJTn1、pJTn2、pJTn3、pJTn4、pJTn5或pJTn6；

啟動(dòng)子Promoter1、Promoter2、Promoter3、Promoter4、Promoter5、Promoter6的序列分別為WP_010308738 .1、WP_101376528 .1、WP_010308657 .1、WP_010316107 .1、WP_010308482 .1、WP_010315430 .1所示序列；

片段SEG-pro1、SEG-pro2、SEG-pro3、SEG-pro4、SEG-pro5、SEG-pro6的序列分別為啟動(dòng)子Promoter1、Promoter2、Promoter3、Promoter4、Promoter5、Promoter6的序列兩端分別加上NheI/BamHI酶切位點(diǎn)；

所述質(zhì)粒pHHB736、質(zhì)粒pJTn1、質(zhì)粒pJTn2、質(zhì)粒pJTn3、質(zhì)粒pJTn4、質(zhì)粒pJTn5、質(zhì)粒pJTn6即所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒。